Ингибирование теломеразы человека (1105569), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Инкубировали чашку при 37С в течение 16 часов.1063.5.8. Выделение плазмидной ДНК для клонирования.Выделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью наборареагентов для выделения плазмидной ДНК GeneJET Plasmid Miniprep Kitфирмы Thermo Scientific согласно протоколу с использованием фирменныхрастворов.Колонию клеток штамма E. coli, несущую определенную плазмиду,помещали в 5 мл среды LB, содержавшей соответствующий антибиотик, иинкубировали при перемешивании в течение 16 ч на 37С. Клетки осаждалицентрифугированием при 7000 об/мин 5 мин, ресуспендировали в 250 мклраствора Resuspension buffer (GeneJET Plasmid Miniprep Kit), добавляли 250 мклраствора Lysis buffer (GeneJET Plasmid Miniprep Kit), перемешивали дообразования вязкого раствора.
К полученному раствору добавляли 350 мклраствора Neutralization solution (GeneJET Plasmid Miniprep Kit), перемешивалидо появления белых хлопьев. Суспензию осаждали центрифугированием при14000 об/мин 5 мин, отбирали супернатант и пропускали его через колонку длявыделения ДНК (GeneJET Plasmid Miniprep Kit), промывали эту колонку 500мкл буферного раствора Wash buffer, затем повторили промывку. Элюировали сколонки ДНК 50 мкл водой mQ.3.6.
Выделение плазмидной ДНК для трансфекции в эукориотическиеклеткиВыделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток проводили сиспользованием набора реагентов для выделения плазмидной ДНК фирмыThermo Scientific (GeneJET Plasmid Miniprep Kit). Колонию клеток E. Coliтрансформированных плазмидой описанной выше в разделе 3.2.7, помещали в100 мл среды LB, содержавшей соответствующий антибиотик, и инкубировали107при перемешивании в ночь на 37С. Клетки осаждали центрифугированием при5000 об/мин 10 мин, ресуспендировали в 1 мл Resuspension buffer (GeneJETPlasmid Miniprep Kit) и инкубировали при комн. темп. 15мин.
Далее добавляли2 мл Lysis buffer (GeneJET Plasmid Miniprep Kit), перемешивали до образованиявязкого раствора и инкубировали 5-10 мин во льду. К полученному растворудобавляли 1,5 мл Neutralization solution (GeneJET Plasmid Miniprep Kit),перемешивалидопоявлениябелыххлопьев.Суспензиюосаждалицентрифугированием при 18000 об/мин 20 мин при 10С. К супернатантудобавили 2,7 мл изопропанола, перемешали и инкубировали 20мин при комн.температуре. Далее осадок осаждали центрифугированием при 18000 об/мин,30 мин при 20С. Осадок промывали 70% этанолом, высушили и растворили в 1мл воды mQ.Для очистки плазмид от эндотоксинов для последующей трансфекции вэукориотические клетки использовали экстракцию эндотоксинов реагентомTriton X-114 [172,173].
К 1мл раствору плазмиды добавили 110 мкл 3 М NaOAcс pH 5.5. Далее проводили экстракцию, для этого добавили 20 мкл Triton X-114и проинкубировали во льду с периодическим перемешиванием до полногорастворения Triton X-114. Далее раствор проинкубировали при 55С, 5мин.Водную фазу отделяли центрифугированием на настольной центрифуге примаксимальной скорости и комн. температуре 5мин. Верхнюю водную фазупереносили в другую пробирку и повторяли экстракцию 3-4 раза. Приэкстракции необходимо использовать 1,5 мл пробирки с узким дном.
Послеэкстракции, плазмиду осаждали изопропанолом чтобы избавиться от остатковTriton X-114. Для этого к оставшемуся раствору добавили 0,7 объемовизопропанола, смешали и проинкубировали 20 мин при комн. температуре.Далее осаждали осадок на настольной центрифуге при максимальной скорости108и 4С 20 мин. Осадок промывали 70% этанолом, высушивали и растворяли вводе mQ. Концентрацию определяли по адсорбции при 260/280 нм.3.7. Трансфекция плазмид в эукориотические клетки и обработка клетоквальпроевой кислотой (ВПА)Трансфекцию проводили в 24-луночных плашках для культивированияклеток.
Для этого смесь плазмид массой 0,5 мкг экспрессирующих hTERT иhTR, в массовом отношении 1:10 соответственно, разбавляли средой OptiMEM®I Medium до объёма 25мкл. Далее разбавленная смесь плазмидсмешивали с равным объемом Lipofectamine 2000, разбавленного в 25 разсредой Opti-MEM®I Medium. Полученную смесь инкубировали при комнатнойтемпературе 15 мин и добавили в HEK293E или HEK293T клетки, которыхпредварительно посеяли в 24-луночной плашке и проинкубировали один день всреде DMEM при 37С, 5% СО2, во влажном воздухе.Препарат Конвулекс разбавили средой ДМЕМ в 10 раз, в результатеполучили 200мМ раствор вальпроевой кислоты (ВПА). 2,5мкл 200мМ раствораВПА добавили в среду с трансфецированными клетками.Инкубацию клеток трансфецированных плазмидами и/или обработаннымиВПА продолжили еще 2 дня.
После этого клетки промывали 1x PBS буфером,ресуспендировали в 0,2мл CHAPs буфере и инкубировали 30 мин во льду.Затем полученный лизат центрифугировали при 16000g, 30 мин, 4ºС.Полученный раствор использовали для анализа количества теломеразы в клетке(определяли уровень hTR и теломеразную активность).1093.8. Экспрессия и очистка теломеразыДля экспрессии теломеразы клеточную линию HEK293E выращивали всреде ДМЕМ при 37С, 5% СО2 и трансфецировали плазмидами p-DS-SFFVhTERT и pBluescript-DS-U1-hTR.
Для этого HEK293E клетки в 10см чашкепетри трансфецировали 22 μг плазмидами и Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Дляэтого смесь плазмид массовом отношении 1:10 соответственно (2 мкг p-DSSFFV-hTERT and 20 мкг pBluescript-DS-U1-hTR) разбавляли средой OptiMEM®I Medium до объёма 1,5 мл. Далее разбавленная смесь плазмидсмешивали с равным объемом Lipofectamine 2000, разбавленного в 26 разсредой Opti-MEM®I Medium. Полученную смесь инкубировали при комнатнойтемпературе 15 мин и добавили в HEK293E клетки в 10 см чашке.
После 2-хдней инкубации после трансфекции, клетки пересевали в T150 матрац иинкубировали еще 2 дня. Инкубацию проводили в среде DMEM при 37С, 5%СО2, во влажном воздухе.После этого клетки промывали 1x PBS буфером, ресуспендировали в 10млCHAPs буфере и инкубировали 30 мин во льду. Затем лизат центрифугировалипри 16000g, 30мин, 4ºС. Затем 5мл аликвоты полученного S16 экстрактацентрифугировали при 100000g, 45мин, 4ºС через 1мл CHAPs буферасодержащий 20% глицерин.
Для этого S16 экстракт наслаивали передцентрифугированием на содержащий глицерин CHAPs буфер. Центрифужнуюпробирку предварительно обработали раствором 6 мг/мл BSA в течение 2-хчасов. Полученный супернатант наносили на поверхность CHAPs буфера,содержащего 20% глицерин. Затем препарат центрифугировали при 210000g, 2часа, MLA-80 ротор,4ºС в (Optima MAX-XP Ulracentifugaion, Beckman Coulter).Осадок растворяли в 1мл ТРАП 1х буфере, содержащим 10% глицерина.110Полученный препарат аликвотили по 10-40 мкл и быстро заморозили в жидкомазоте. Хранили при температуре -80ºС.3.9. Метод измерения ингибирования теломеразы in vitro (RQ-ТРАП)Количественный RQ-ТРАП с разбавлением проводили в два этапа.
Напервом этапе к 5 мкл очищенной теломеразы (предварительно в 50 разразбавленный препарат, полученный после выделения в 1х ТРАП буфере)добавили 5мкл исследуемого ингибитора в том же буфере. Смесь инкубировали10мин при комнатной температуре, далее добавляли 5мкл mix1. Реакционнуюсмесь инкубировали при 30ºС, 30мин и инактивировали нагреванием на 80ºС,10мин. Затем 150 мкл ТРАП буфера добавляли для разбавления смеси. Навтором этапе проводили ПЦР реакцию в объёме 10мкл смеси, содержащей 5мклmix2 и 5 мкл разбавленного раствора, полученного на первом этапе.Приготовление ПЦР смеси проводили при 0°С.
Смесь mix2 готовили в большихколичествах во льду, аликвотили и хранили при -80°С. При каждом измерениииспользовали новую аликвоту. Амплификацию проводили в 384-луночныхПЦР плашках на приборе CFX-384 Real-Time System, C1000 Thermal Cycler(Bio-Rad), за 30 циклов с этапами 30 сек при 95ºC, 30 сек при 60ºC и 60 сек при72 ºC. Измерение флуоресценции SYBR Green проводили на шаге 60 ºC.Определение Ct величины проводили автоматически программой Bio-Rad CFXManager (версия 1.6.541.1028) с использованием «пороговой линии». Всерасчеты, нелинейные аппроксимации и построение графиков проводилипрограммой Graph-Pad prism.
Для проверки влияния на ПЦР, ингибиторытеломеразы добавляли как до теломеразной реакции, так и после. Всеизмерения проводились по три раза. Также каждое измерение по крайней мерееще раз повторяли в другие дни.111Для определения линейности сигнала ПЦР в реальном времени отактивности теломеразы, при каждом эксперименте использовали 2-х кратноепоследовательноеразбавлениеочищеннойтеломеразы.Дляполучениястандартной кривой, необходимой для количественных расчетов, при каждомэксперименте использовали 10-ти кратное последовательное разбавление TSR8олигонуклеотида. Исследуемые олигонуклеотиды использовали в интервалеконцентрации 0.01нM-10мкM.3.10.
Прямой метод измерения теломеразной активности20мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл 10х теломеразного буфера, 2мкл очищенной теломеразы, 40 мкM dATP, 80 мкM dTTP, 2 мкM dGTP, 20 мкCi[32P]-dGTP (3,000 Ci/ммоль) и 35 нM 5’-биотинилированный теломерныйпраймер b-HuG3, а так же исследуемое на ингибирование активностителомеразы вещество инкубировали 45 мин при 30ºС. Реакцию остановливалидобавлением ЭДТА, до конечной концентрации в смеси 25 мM. Следовыеколичества 5’радиоактивно меченного праймера содержащего биотин на 3’конце 15bpLC добавляли в реакционную смесь в качестве конроля нанесения ивнутреннегостандарта.Непрореагировавшийрадиоактивныйнуклеотидтрифосфат удаляли из реакционной смеси с помощью 5мклстрептавидиновых магнитных шариков (Dynal), которые предварительнопромывали 2х BW буфером и ресуспендировали в 20 мкл этого же буфера.Инкубациювзаимодействиябиотинилированныхпраймеровсстрептавидиновыми магнитными шариками проводили в течение 10 мин прикомнатной температуре.
Затем магнитные шарики промывали два раза 1х BWбуфером и один раз TE буфером. Затем промытые магнитные шарикиресуспендировали в 10мкл формамидной краски, нагреты до 95ºС 5мин. 4мкл112аликвоты образца наносили на 10% денатурирующий полиакриламидный гель.Разделенные фрагменты ДНК визуализировали при помощи Typhoon FLA 9500.Денситометрический анализ изображения проводили с помощью программыTotalLab Quant. IC50 рассчитывали с помощью программы GraphPad Prism.3.11. Введение радиоактивной метки на 5'-конец олигонуклеотида 15bpLCРеакцию проводили в 20 мкл.
Реакционная смесь содержала 2 мкл 10хбуферного раствора для Т4 полинуклеотидкиназы, 20 пмоль 15bpLC, 10 ед. Т4полинуклеотидкиназы (MBI Fermentas, 10 ед./мкл) и 10 пмоль [γ-32P]ATP(удельная активность 220 ТБк/ммоль или 6000 Ки/ммоль). Кинированиепроводили при 37°C в течение 30 минут, после чего фермент инактивировалинагреванием в течение 15 минут при 75°C.3.12. Трансфекция клеток ингибиторными олигонуклеотидами иполучение клеточного экстрактаТрансфекцию проводили на HEK293E клетках с помощью Lipofectamine2000(Invitrogen)в96-луночныхплашкахдлякультивированияэукориотических клеток. Олигонуклеотды последовательно разбавляли средойOpti-MEM®I Medium до концентрации 220 мкM, 22 мкM, 2.2 мкM, 220 нM, 22нM, 2.2 нM, 0.22 нM, 0.022 нM соответственно.
В дальнейшем 5 мклразбавленного олигонуклеотида смешивали с 5мкл Lipofectamine 2000, которуюпредварительно разбавляли в 17,7 раз средой Opti-MEM®I Medium в 96луночной плашке и проинкубировали 15мин при комнатной температуре.2.5*104 HEK293 клеток, ресуспендировали в 100мкл среды DMEM и добавляли113в каждую ячейку. После 2-х дней инкубации при 37ºС в присутствии 5% СО2,клетки промыли 1х PBS буфером, затем ресуспендировали в 100мкл CHAPSбуфера и инкубировали 30мин во льду. От клеточного дебриса избавлялисьцентрифугированием при 2464g, 30мин при 4ºС.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
