Ингибирование теломеразы человека (1105569), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Необходимоотметить, что c3G почти не влиял на сборку теломеразы (рис. 40В).В ходе разработки новых подходов ингибирования теломеразы былисозданы химерные олигонуклеотиды, состоящие из двух модифицированныхолигонуклеотидов,соединенныхненуклеотиднымлинкеромкомплементарных к разным участкам hTR. Было показано,ичто этиолигонуклеотиды не цитотоксичны и не вызывают деградацию мишени hTR вклетке. Был определен механизм действия таких химер, заключающийся вингибировании сборки теломеразы. Также было показано, что усилениеингибированиятеломеразывклеткехимернымиолигонуклеотидамиобеспечивается увеличением их стабильности за счет защиты на 5’-конце.При анализе ингибирующих способностей химер in vitro оказалось, чтохимеры состоящие только из разнонаправленных М частей, ингибируюттеломеразу в 7 раз лучше, чем индивидуальный М.
Это дополнительноподтверждает, что в условиях in vitro теломераза является димером, такаядимеризацияспособствуетингибированиютеломеразыхимерным93олигонуклеотидом М*с3М. Разница для тех же химер и отдельного М прианализе in vivo составила несколько порядков, что свидетельствует в пользудимеризаций hTR в процессе сборки.В условиях in vitro химерные олигонуклеотиды состоящие из M и N частейингибировали теломеразу, тогда как слитый MN не ингибировал.
Отсюдаследует, что разработанные химерные олигонуклеотиды состоящие из M и N, Ми М частей уменьшают активность теломеразы в клетке за счет ее прямогоингибирования и за счет блокирования сборки теломеразы одновременно.Такое синергичное действие усиливает ингибирующую способность химерногоолигонуклеотида примерно в 3 раза. В ходе работы также была проверенаспецифичность действия химерных олигонуклеотидов в клетке.Были проанализированы химеры, содержащие части N и J. Такие химерыне содержат последовательностей, комплементарных матричному участку, и засчет этого лишены отрицательных эффектов, показанных для Иметелстата.Эффективность химер JNпри тестировании ингибирования теломеразнойактивности в клетке выше, чем у олигонуклеотида с последовательностьюИметелстата, почти в 30 раз. Доказанный механизм действия, а именно,блокированиесборкителомеразыявляетсянесомненнымплюсомдляпоследующей разработки.2.3.
ЗаключениеИнгибированиеПЦРвТРАПметодеопределениятеломеразнойактивности является одной из серьезных проблем при скринированиипотенциальных ингибиторов теломеразы. На данный момент отсутствуетуниверсальныйметодустраненияингибированияПЦРквадруплекс94стабилизирующими препаратами, а для олигонуклеотидных ингибиторов такихметодов вовсе нет. В данной работе был разработан универсальный методустранения ингибирования ПЦР, основанный на разбавлении теломеразногопродукта в ТРАП после шага теломеразной реакции до амплификации.Использование разбавления пригодно для тестирования ингибиторов различнойприроды,приусловиидостаточногодляамплификацииколичествателомеразного продукта.В ходе работы впервые была создана и использована эписомальнаяконструкция для экспрессии hTR.
При ее использовании количествотеломеразы увеличилось в три раза по сравнению с описанной на данныймомент системой [154]. Это позволило повысить выход содержания теломеразыпри выделении и количество продукта удлинения теломеразой теломеразногосубстрата на первом шаге ТРАП теста.В работе были разработаны новые подходы ингибирования теломеразыолигонуклеотидами. Для этого были предложены химерные олигонуклеотиды,состоящих из двух последовательностей, соединенных ненуклеотиднымлинкером. Показано, что химерные олигонуклеотиды эффективно ингибируюткак работу теломеразы в системе in vitro, так и ее сборку в клетке.Ингибирование активной теломеразы химерным олигонуклеотидом М*с3Меще раз доказывает, что теломераза существует в димерной форме в условиях invitro.Химерные олигонуклеотиды могут стать основой для разработки новыхболее безопасных противоопухолевых препаратов. Например, химерныйолигонуклеотид, содержащий последовательности N и J, не содержиттеломерные последовательности, которые могут взаимодействовать с другимине-теломеразными мишенями.953.
Материалы и методы3.1. Реактивы и биопрепаратыВ работе были использованы следующие реактивы и препараты:– NaCl, NaOAc, KCl, MgCl2, NaOH, KOH, H3BO3, CuCl2, персульфат аммония,бромфеноловый синий, ксиленцианол, бромистый этидий, глицерин, Taqполимераза фирм Merk, Германия и Helicon, Россия;–Tween 20, акриламид, N,N′-метиленбисакриамид, 1,4-дитиотреитол(DTT),КумассиR-250,Д-глюкоза,2-меркаптоэтанол,N,N,N′,N′-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), Helicon, Россия–фенол, уксусная кислота, соляная кислота, хлороформ фирмы Химмед,Россия;–Triton X-100 фирмы Roth, Германия;–этанол фирмы Ферейн, Россия;–TritonX-114,бычийфенилметилсульфонилфлуоридсывороточный(ПМСФ),альбуминспермидин,(BSA),формамид,ампициллин, генетицин, РНКаза А фирмы Sigmaaldrich;–этилендиаминтетраацетаттрис(гидроксиметил)аминометаннатрия(Tris),(ЭДТА),бакто-триптон,дрожжевойэкстракт, бакто-агар, мочевина, диметилсульфоксид (ДМСО) фирмыAmersco, США;–3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолиябромид(МТТсоль), DMEM, 100х пен-стреп, 100х пируват натрия фирмы ПанЭко, Россия;–эмбриональная сыворотка (FBS) фирмы HyClone;–легкоплавкая агароза для электрофореза фирмы Life Technologies (США);96–GlutaMax 100x, Opti-MEM®I Medium, Lipofectamine 2000, SYBR Green I10000x, набор реагентов для выделения плазмидной ДНК и набор реагентовдля выделения ДНК из агарозного геля, ДНКаза I (DNase I, RNase-free), Т4ДНК-лигаза, Taq-полимераза, полинуклеотид киназа T4, эндонуклеазырестрикции EcoRI, SalI, NotI, KpnI, Kpn2I, MfeI и фирменные буферныерастворы к ним фирм Thermo Scientific и Invitrogen (США);–[α-32P]dGTP, [γ-32P]ATP фирмы «Изотоп», Россия;–немодифицированныеолигодезоксирибонуклеотидыбылисинтезированы фирмой Синтол, Россия;–модифицированные и химерные олигонуклеотиды были синтезированыТ.С.
Зацепиным;–Вальпроевая кислота (Конвулекс фирмы Gerot Pharmazeutika, Австрия)–низкомолекулярноесоединение2-алкилтио-5-арилметилен-4H-имидазолин-4-он был синтезирован в кафедре органической химиихимичского факультета МГУ в лаборатории профессора Зыка Н.В. вгруппе Мажуги А.С., а антрахиноновые производные и его модификациибыли синтезированы в лаборатории института новых антибиотиков им.Г.Ф.
Гаузе РАМН.Табл. 8.Растворы, использовавшиеся в работе.Название раствораСостав растворасреда LB,1% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1%твердая среда LBNaCl (1.5% бакто-агар для твердой среды)среда TB1.2% бакто-триптон, 2.4% дрожжевой экстракт,0.4% глицерин, 0.231% KH2PO4, 1.254% K2HPO49710х буферный раствор 670 мМ Tris-HCl рН 8.8, 66 мМ MgCl2, 10 мМдля Т4 ДНК-ДТТ, 168 мМ (NH4)2SO4полимеразы(Thermo Scientific)10х буферный раствор 500 мМ Tris–HCl (pH 8.2), 100 мM MgCl2, 1 мМдля Т4EDTA, 50 мМ DTT, 1 мМ спермидинполинуклеотидкиназы(Thermo Scientific)10x буферный раствор 100 мМ Tris-HCl рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 1 М NaCl,B (Thermo Scientific)1 мг/мл БСА10x буферный раствор 500 мМ Tris-HCl рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 1 М NaCl,О1 мг/мл БСА(Thermo Scientific)10х буф.
р-р «Tango»330 мМ Tris-ацетат рН 7,9, 100 Mg(OАc)2, 660 мМ(Thermo Scientific)KOAc, 1 мг/мл БСА10x KpnI буф. р-р100 мM Tris-HCl (pH 7.5), 100 мM MgCl2, 0.2%(Thermo Scientific)Triton X-100, 1 мг/мл БСА.10x ΔKpnI-SalI буф. р- 400мMTris-HCl (pH 8.3), 1 M NaClр6x LA10 мM Tris-HCl (pH 7.6), 0,03% ксиленцианол, 0,03% бромфеноловый синий, 60 мМ ЭДТА, 60%глицерин1хTBE0,1 М Tris, 0,1 M H3BO3, 2 мM ЭДТА рН 8,31xPBS140 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1.8мМ KH2PO4, pH 7.3CHAPS буфер10 мM Tris-HCl, pH 7.5, 1 мM MgCl2, 1 мM EDTA,0.1 мM ПМСФ, 5 мM β-меркаптоэтанол, 1мM98ДTT,0.5%3-[(3диметиламмоний)]-1-пропанхоламидопропилсульфонат,10%глицерин1х ТРАП буфер20мMTris-HCl (pH 8.3), 63 мM KCl, 1.5 мM MgCl2,0.1 мг/мл BSA, 0.002% Tween-20, 1мM EGTAmix11х ТРАП буфер, 0.3 µM TS, 0.3 мM dNTP.mix21х ТРАП буфер, 0.4 µM TS, 0.4 µM ACX, 0.4xSYBR Green I (Invitrogen), 0.2мM dNTP, 0.1 U Taqполимераза.1х BW буфер10 мM Tris-HCl [pH 7.5], 1 мM EDTA, 1 M NaClTE буфер10 мM Tris-HCl [pH 8.0], 1 мM EDTA.1x Pfu буфер20 мM Tris-HCl (pH 8.8 при 25°C), 10 мM(Thermo Scientific)(NH4)2SO4, 10 мM KCl, 0,1% (обьемн.) Triton X100, 0,1мг/мл BSA.1x Taq-буфер10 мM Tris-HCl (pH 8.8 at 25°C), 50 мM KCl, 0.08%(v/v) Nonidet P4010xтеломеразный 500 мM Tris-HCl [pH 8.0], 500 мM KCl, 10 мMбуферспермидин, 50 мM ß-меркаптоэтанол, 10 мMMgCl2,5х RT буфер250 мM Tris-HCl (pH 8.3 при 25°C), 375 мM KCl,15 мM MgCl2, 50 мM ДТТсреда ДМЕМDMEM, 10% FBS, 1x GlutaMax, 1x пен-стреп, 1хпируват натрия99Табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
