Ингибирование теломеразы человека (1105569), страница 13
Текст из файла (страница 13)
9.НазваниеОлигонуклеотиды, использованные в работе.ДНКолигонуклеотиилиНуклеотидная последовательностьдаРНКKpnI-forw-DSДНК5'-TTGGTACCAAACCGTGACAGCTCATGG-3'SalI-rev-DSДНК5'-TTGTCGACGAGGGCATTAGCAATAGTG-3'SalI-forw-DSДНК5'-TTGTCGACAAACCGTGACAGCTCATGG-3'rev-DSДНК5'-GAGGGCATTAGCAATAGTG-3'forw-DSДНК5'-AAACCGTGACAGCTCATGG-3'TSДНК5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’ACXДНК5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTA-3’TSR8ДНК5’-AATCCGTCGAGCAGA(GTTAGG)8-3’hTR-FДНК5’-GTGGTGGCCATTTTTTGTCTAAC-3’hTR-R1ДНК5’-TGCTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’hTR-forwardДНКhTR-reverseДНКFwДНК5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’RvДНК5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’15bpLCДНК5′-CAAGTCATCTGTACA-биотин-3′b-HUG3ДНК5′- биотин-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3′NДНК5’-GTTGCCCCGGGCCGACCGCG-NH2-3’HuG2RРНК5′-UUAGGGUUAGGG-NH2-3′HuG4RРНК 5′-UUAGGGUUAGGGUUAGGGUUAGGG -NH2-3′5’-GGGGAAGCTTTAATACGACTCACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGGCCTG-3’CCCCGGATCCTGCGCATGTGTGAGCCGAGTCCTGGG1003.2. Получение S100 экстрактаHEK293T клетки, вырашенные в 10 см чашке Петри промывали 1x PBSбуфером, ресуспендировали в 2мл CHAPs буфере и инкубировали 30 мин вольду.
Затем лизат центрифугировали при 100000g, 60мин, 4ºС. ПолученныйS100 экстракт разаликвотили по 5-40 мкл и быстро заморозили в жидком азоте.Хранили при температуре -80ºС.3.3. Проверка деградации олигонуклеотидов в S100 экстрактеПри проверке деградации олигонуклеотида, 20мкл смеси, содержащей 2мклаликвоты S100 экстракта, 4мкл 5х ТРАП буфера и 1мкМ олигонуклеотида N,инкубировали разное время при 37С. После окончания инкубации смесьинактивировали добавлением 20 мкл фенола и перемешиванием с помощьювортекса. Центрифугировали 16000 g, 2мин. Отбирали водную фазу. К воднойфазе добавили 4мкл 6х LD буфера.
Электрофорез проводили в 20%денатурирующем полиакриламидном геле с 7М мочевиной в течении 1часа принапряжении тока 210V в буфере 1x TBE, после разделения гель 10минокрашивалирастворомSYBR-GreenI,приготовленныйразбавлениемисходного раствора SYBR-Green I в 10000раз буфером 1x TBE. Затемокрашенный гель детектировали на приборе PhosphoImager.3.4. ТРАП с визуализацией в полиакриламидном геле («Классический»ТРАП)Готовили смеси из 10 мкл 5хТРАП буфера, 1мкл TS-праймера 20мкМ,2мкл dNTP (по 2.5 мМ dATP, dGTP, dTTP, dCTP), добавляли соответствующийолигонуклеотид для ингибирования и доводили до 49,5мкл деионизованной101водой.
Приливали по 0,5мкл клеточного S100 экстракта, перемешивали, иинкубировали при 25ºС на 30 мин. После шага удлинения праймера к смесиприливали 1мкл ACX-праймера 20мкМ, 0,4мкл Taq-полимеразы (5u/мкл).Проводили 28 циклов ПЦР: 94ºС 30сек; 50ºС 30сек; 72ºС 90сек. Продуктыудлинения праймера теломеразой разделяли в 20% полиакриламидном геле втечении 3-х часов при напряжении тока 210V в буфере 1x TBE и 20 минокрашивали раствором SYBR-Green I, который готовили разбавлениемкоммерчески доступного раствора SYBR-Green I в 10000 раз буфером 1x TBE.Затем окрашенный гель детектировали на приборе PhosphoImager.3.5. Клонирование3.5.1.
Получение конструкции для рекомбинантной экспресиителомеразыДля экспрессии теломеразы человека были получены плазмиды дляэкспрессии основных компонентов теломеразы: для hTERT p-DS-SFFV-hTERTи для hTR pBSK-DS-U1-hTR. pBSK-DS-U1-hTR получали вставкой DS элементав плазмиду pBSK-U1-hTR-U2/U5 (подарок от Shang Li [170], содержащая hTRген под U1 промотор в pBluescript векторе), которую предварительнообрабатывали эндонуклеазами рестрикции KpnI и SalI. DS элемент являетсячастью ориджина репликации EBV вируса и его получали из pCEP4 вектора(Invitrogen) с помошью ПЦР, используя праймеры KpnI-forw-DS иSalI-rev-DS, споследовательной обработкой ПЦР продукта эндонуклеазами рестрикции KpnIи SalI.
p-DS-SFFV-hTERT получали за счет вставки DS элемента в p-SFFVhTERT плазмиду, которую предварительно обработывали эндонуклеазойрестрикции SalI. DS элемент получали ПЦР реакцией используя праймеры SalI-102forw-DS и SalI-rev-DS с последующей обработкой ПЦР продукта эндонуклеазойрестрикции SalI. Плазмиду p-SFFV-hTERT получали следующим образом:кДНК hTERT вставляли в вектор LeGO-iG2 [163], которую предварительнообработали эндонуклеазами рестрикции EcoRI и NotI.
Полученную плазмидуобработали эндонуклеазами рестрикции Kpn2I и NotI, затем обработали Т4ДНК полимеразой. Далее полученную плазмиду лигировали, затем еще разобработали эндонуклеазой рестрикции MfeI и перелигировали. кДНК hTERTполучили обработкой вектора pGRN145 (Geron) эндонуклеазами рестрикцииEcoRI и NotI. Лигирование проводили с помощью набора реагентов Rapid DNALigation Kit компании Thermo Scientific по методике производителя.ДетальноеописаниеПЦР,полученияпродуктовобработкиэндонуклеазами рестрикции, разделение фрагментов и их выделение, и другиенеобходимые процедуры представлены ниже.3.5.2. ПЦРВ пробирке 0,2 мл составляли следующую ПЦР смесь:10х буферный раствор для Taq-полимеразыматричная ДНК (плазмидная или геномная)5 мкл1 мкгпраймер 120 пмольпраймер 220 пмольсмесь dNTPMgСl2Полимераза Taq или Taq:Pfu (10:1) (5 ед/мкл)Н2Опо 0,1 мМ каждого1 мМ0.5 мклдо 50 мклТщательно перемешивали и помещали в прибор для проведения ПЦРMastercycler gradient фирмы Bio Rad.
Параметры ПЦР 30 циклов: 94С 30сек,55С 30 сек, 72С 1мин.103После проведения ПЦР в смесь добавляли 10мкл 6х LА раствора,проводили разделение фрагментов ДНК в 0,8–1% агарозном геле. Принеобходимости проводили ПЦР с колонии клеток E. coli. Для этого 20 мклночной культуры, полученный из колонии клеток, центрифугировали примаксимальной скорости на настольной центрифуге 1мин.
Осадок подвергалиПЦР. Параметры ПЦР оставались такие же.3.5.3. Разделение фрагментов ДНК в агарозном гелеДля приготовления агарозного геля добавляли 0,8–1,0 г легкоплавкойагарозык100млраствора1xTBE(табл.2).Растворпрогреваливмикроволновой печи до полного растворения агарозы.
Полученный растворохлаждали до ~ 40–60С, добавляли 5 мкл водного раствора бромистого этидия1 мг/мл, перемешивали, выливали в плашку. После застывания геля вносилиобразцы в ячейки и проводили электрофорез при напряжений тока ~ 100-150 В.Разделение фрагментов ДНК контролировали с помощью камеры с УФ лампой.3.5.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили с помощьюнабора реагентов для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля фирмыThermo Scientific (GeneJET Gel Extraction Kit) согласно протоколу сиспользованием фирменных реагентов.
Полоску агарозного геля массой ~ 0.10.3 мг, содержавшую нужный фрагмент ДНК, растворяли в 0.1-0.3 млбуферного раствора Binding buffer (GeneJET Gel Extraction Kit) при 50С до104полного растворения геля. Перемешивали переворачиванием, пропускали черезколонку для выделения ДНК. Промывали колонку 700 мкл буферного раствораWash buffer (GeneJET Gel Extraction Kit), элюировали ДНК 25 мкл воды mQ.Концентрацию ДНК определяли по поглощению при 260 нм.3.5.5. Приготовление векторов и вставокСоставляли следующую реакционную смесь:ДНК (плазмидная или ПЦР-фрагмент)3 мкг10х буферный раствор для эндонуклеазы рестрикции(каталог фирмы MBI Fermentas)2 мклэндонуклеаза рестрикции 110 едэндонуклеаза рестрикции 2Н2О0 или 10 еддо 20 мклПолученную смесь инкубировали при 37˚С в течение 2–4 ч.
Добавляли 2мкл LA раствора, наносили на агарозный гель и приводили разделениефрагментов ДНК. ДНК-фрагмент нужной длины вырезали из геля и выделяли спомощью набора реагентов для выделения ДНК из агарозного геля (ThermoScientific). При обработке двумя эндонуклеазами рестрикции KpnI и SalI,использовали последовательную обработку. Для этого после инкубацииплазмиды или вставки эндонуклеазой рестрикции KpnI, дополнительнодобавляли 2мкл 10x ΔKpnI-SalI буферный р-р и 10 ед.
эндонуклеазырестрикции SalI, и смесь инкубировали при 37˚С еще 2-4 ч.1053.5.6. Приготовление компетентных клеток E. coliСвежую колонию клеток E. сoli штамма JM109 помещали в 5 мл средыLB (табл.2) и инкубировали при 37С ночь. 1мл ночной культуры добавлялось в300мл LB и инкубировалось при температуре 16С при перемешивании (200об/мин) до оптической плотности А600 ~ 0,5. Культуру клеток выдерживали втечение 10 мин во льду, переносили в предварительно охлажденныецентрифужные пробирки и осаждали центрифугированием в предварительноохлажденном роторе JA 14 при 5000 об/мин, 4С в течение 10 мин.
Супернатантсливали и ресуспендировали осадок в 100 мл охлажденного до 4С буферногораствора ТВ (табл.2). Суспензию клеток инкубировали при помешивании при0С 10 мин. Клетки осаждали центрифугированием в роторе JA 14 при 5000об/мин, 4С 10 мин, промывали 100 мл охлажденным буферным раствором ТВ(табл.2), инкубировали при 0С 10 мин и осаждали центрифугированием.Клетки ресуспендировали в 20 мл буферного раствора ТВ, добавляли 1,4 млДМСО (до 7%) и инкубировали 10 мин при 0С. Суспензию клеток переносилипо 100 мкл в 1,5 мл предварительно охлажденные стерильные пробирки ибыстро замораживали в жидком азоте. Клетки хранили при температуре –70С.3.5.7.
Трансформация компетентных клеток E. coliПробиркускомпетентнымиклеткамиразмораживаливольду,добавляли 1–5 мкл раствора плазмидной ДНК (~ 0,1 мкг) в дистиллированнойводе, инкубировали 30 мин при 0С. Затем прогревали смесь на водяной бане втечение 40–50 сек при 42С, охлаждали до 0С, добавляли 800 мкл среды LB иинкубировали 1 час при 37С. Аликвоту 10–20 мкл трансформационной смесивысевали на чашку Петри с твердой средой LB, содержавшей соответствующиеантибиотики.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
