Ингибирование теломеразы человека (1105569), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Концентрацию белкаопределяли по стандартной методике Брэдфорд [173].3.13. RQ-ТРАП in vivo5мкл клеточного экстракта, полученного после трансфекции клетоколигонуклеотидами, разбавляли в 10раз 1x ТРАП буфером. Затем 5 мклразбавленного экстракта добавляли к 5мкл смеси mix2 во льду. ТРАП анализпроводили в одну стадию инкубированием реакционной смеси при 10ºС 1час споследующей ПЦР реакцией. ПЦР, обработка данных и использованиекалибровочной кривой описаны выше (раздел 3.8).
Известно, что Taqполимераза активна в интервале температур 15–100°C. Мы наблюдалисохранение активности теломеразы во льду. Следовательно, 10°C достаточно,чтобы поддерживать теломеразу активной, тогда как Taq-полимераза неактивнав этих условиях. При использовании буфера, вместо клеточного экстракта,сигнал появляется при 27–30 циклах. Не трансфецированный клеточныйэкстракт последовательно 2-х кратно разбавляли и использовали для проверкилинейности сигнала от активности теломеразы.3.14. Проверка сборки теломеразыДля проверки сборки мы использовали клеточные экстракты полученныепри трансфекции клеток 5мкМ олигонуклеотидами.
500 мкл 5-ти кратно114разбавленного ТРАП буфером клеточного экстракта центрифугировали всахарозномградиенте.Сахарозныйградиентзамораживанием-размораживанием 20%сахарозыполучалив1х2-хкратнымТРАПбуфере.Центрифугирование проводили в SW-41 Ti роторе (Beckman) при 4°C, 20h,111132g (30000 об/мин) в J2-HS Beckman центрифуге. Фракции по 500мклсобрали начиная со дна пробирки. Для проверки теломеразной активности скаждой фракции отбирали по 2,5мкл и использовали в RQ-ТРАП in vivo.3.15.
Определение количества hTR с помощью метода обратнойтранскрипции сопряженной с ПЦР (RQ-ПЦР)К каждой фракции добавляли 2 мкл гликогена (20мг/мл, Roche AppliedScience). Затем РНК экстрагировали смесью фенол/хлороформом (1:1),осаждали этанолом и растворяли в 50мкл mQ воды. Полученный раствор РНКподвергали обратной транскрипции. Реакцию проводили в обьеме 10 мкл,содержащим 2 мкл 5x RT буфер, 2.5 мкл полученного раствора РНК, 1 мкМолигонуклеотида hTR-R1, 0.5мМ dNTP, 0.2 мкл (1 ед.) Maxima Enzyme mix(Thermo Scientific) при 50°C, 2час.
Затем реакционную смесь разбавили в 10разmQ водой. 5 мкл разбавленного раствора использовали в ПЦР реакции,суммарный объем реакционной смеси составил 10мкл и содержал 1х Taqбуфер, 0.1 мM dNTP, 0.2 мкM hTR-F, 0.2 мкM hTR-R1, 1.5 мM MgCl2, 0.04U/мкл Taq-полимераза, 0.25x SYBR-Green I в приборе CFX-96 Real-Time System(Bio Rad), за 30 циклов (30 сек при 95°C, 30 сек 58°C и 60 сек при 72°C). Дляполучениякалибровочнойкривойиспользовали10-тикратноепоследовательное разбавление раствора in vitro синтезированной hTR РНК (см.раздел 3.16).1153.16. Получение hTR методом in vitro Т7-транскрипцииМатрицу для Т7-трансрипции получали с помощью ПЦР (30 циклов: 40сек94˚C, 20сек 58˚C, 90сек 72˚C) в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1нгплазмиды pBluescript-DS-U1-hTR, 1х Pfu буфера (Fermentas), 0,5 мкМ T7-hTRforward праймера, 0.5 мкМ hTR-reverse праймера, 0.2 мМ dNTP, 0.1 U Pfuполимеразы.
ПЦР продукт очищали с помощью GeneJET PCR Purification Kit(Thermo Scientific). Затем РНК синтезировали с помощью MEGAScript-T7 Kit(Invitrogen).СинтезированнуюРНКэкстрагировалипоследовательнонасыщенным раствором фенола и хлороформом, осаждали этанолом, затемочищали на 5% поликариламидном геле в денатурирующих условиях. Дляэтого после электрофореза, гель окрашивали в течение 10мин раствором SYBRGreen I, который готовили разбавлением коммерческого раствора SYBR-Green I10000хв10000разбуфером1xTBE.Послеразделенияфрагментывизуализировали УФ лампой, соответствующую hTR полосу вырезали и РНКэкстрагировали 1х ТЕ буфером в присутствии фенола в течение ночи.
РНК изполученного раствора осаждали этанолом, осадок растворяли в воде mQ.Концентрацию определяли по адсорбции при 260/280 нм на приборе Nano Drop2000 (Thermo Scientific).3.17. Определение уровня hTR в клетках с помощью RQ-ПЦР2.5 мкл клеточного экстракта, полученного для измерения ингибированияолигонуклеотидами теломеразы в клетке, использовали для измерения уровняhTRвклетках,трансфецированныхолигонуклеотидами.Обратнуютранскрипцию проводили по протоколу, описанному в разделе 3.15. Мызаметили, что клеточный экстракт не влияет на обратно транскрипционную116реакцию, однако ингибирует ПЦР. 7-ми кратное разбавление продукта обратнотранскрипционной реакции mQ водой элиминировал эффект на ПЦР. 5 мклразбавленный кДНК использовали в ПЦР как описано в разделе 3.15.
Нетрансфецированныйклеточныйэкстрактпоследовательно2-хкратноразбавляли, и использовали как позитивный контроль и для проверкилинейности сигнала от количества клеточного экстракта. Полученныерезультаты по уровню hTR в клетке нормировали делением по уровню GAPDH,который параллельно анализировали по той же методике и на том же препаратес праймерами Fw и Rv. Для этого в анализе вместо праимеров hTR-R1 и hTR-Fиспользовали праймеры Fw и Rv соответственно. Все ПЦР амплификациипроводили трехкратно.3.18. МТТ анализ цитотоксичности олигонуклеотидов20мкл соли 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия бромид(МТТ) с концентрацией 5 мг/мл (в PBS 1x) добавляли в HEK293 клетки,трансфецированные олигонуклеотидными ингибиторами и инкубированные втечение 2-х дней по протоколу описанному в разделе 3.12.После 3-х часов инкубации в присутствии МТТ соли при 37ºC, 5% CO2 средуудалили и добавили 150 мкл ДМСО с последующим перемешиванием.Флуоресценцию образцов измеряли при 555 нм, в качестве референсногосигнала использовали 670 нм.
Затем сигнал, полученный при 670 нм отнималиот сигнала измеренного при 555 нм. Сигнал 670нм – соответсвует возбужденииобразца светом с длиной волны 607нм, 555нм – соответсвует длине волны555нм. Полученные данные нормализовали к сигналу, полученному отнетрансфецированныхпринимали как 100%.клеток.Сигналотнетрансфецированныхклеток1174.
Выводы1. Новая система экспрессии основных компонентов теломеразного комплексачеловека позволяет повысить уровень теломеразы в клетках HEK293E посравнению с описанными ранее.2. Разработанный метод количественного определения теломеразной активностипозволяет измерять ингибирование теломеразы веществами, влияющими наПЦР и стабилизирующими G-квадруплексы.3. Производныеантра[2,3-b]тиофен-5,10-диона, 2-алкилтио-5-арилметилен-4H-имидазолин-4-он и его медь содержащий комплекс являются ингибиторамителомеразы.4.
Химерные олигонуклеотиды, состоящие из двух частей, комплементарныхразным районам hTR и соединенных ненуклеотидным линкером, ингибируютсборку теломеразы.5. Димеризация теломеразы человека подтверждена с помощью серии химерныхолигонуклеотидов, ингибирующих активность теломеразы.1185. Список литературы[1][2][3][4][5][6][7][8][9][10][11][12][13]Jemal A.., Bray F., Center M., Ferlay J.
Global Cancer Statistics. // CACANCER J CLIN. 2011. V. 61. P. 69–90.Hanahan D., Weinberg R. The Hallmarks of Cancer. // Cell. 200. V. 100. P.57–70.Shay J., Wright W. Telomerase: a target for cancer therapeutics. // CancerCell. 2002. V. 2. P. 57-265.Cimino-Reale G., Pascale E., Battiloro E., Starace G., Verna R., D'AmbrosioE. The length of telomeric G-rich strand 3'-overhang measured byoligonucleotide ligation assay. // Nucleic Acids Res. 2001.
V. 29. P. E35.Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cellstrains.// Exp Cell Res. 1961. V. 25. P. 585-621.Cong Y.S., Wright W.E., Shay J.W. Human telomerase and its regulation. //Microbiol Mol Biol Rev. 2002. V. 66. P. 407-425.Celli G., de Lange T. DNA processing is not required for ATM-mediatedtelomere damage response after TRF2 deletion. // Nature Cell Biology. 2005.V. 7. P.
712 - 718.Cohen S.B., Graham M.E., Lovrecz G.O., Bache N., Robinson P.J., ReddelR.R. Protein composition of catalytically active human telomerase fromimmortal cells. // Science. 2007. V. 30. P. 1850-1853.Weinrich S.L., Pruzan R., Ma L., Ouellette M., Tesmer V.M., Holt S.E.,Bodnar A.G., Lichtsteiner S., Kim N.W., Trager J.B., Taylor R.D., Carlos R.,Andrews W.H., Wright W.E., Shay J.W., Harley C.B., Morin G.B.Reconstitution of human telomerase with the template RNA component hTRand the catalytic protein subunit hTRT. // Nat Genet.
1997. V. 17. P. 498502.Заридзе Д. Канцерогенез. –М.: Медицина, 2004, 576c.Zvereva M. I., Shcherbakova D. M., Dontsova O. A.. Telomerase: structure,functions, and activity regulation. // Biochemistry (Mosc). 2010. V. 75. P.1563-1583.Blagoev K.B. Cell proliferation in the presence of telomerase. // PLoS ONE.2009. V. 4. P. e4622.Hamad N.M., Banik S.S., Counter C.M. Mutational analysis defines aminimum level of telomerase activity required for tumourigenic growth ofhuman cells. // Oncogene. 2002. V. 21. P. 7121-7125.119[14][15][16][17][18][19][20][21][22][23][24]Hodes R.
Molecular targeting of cancer: telomeres as targets. // Proc NatlAcad Sci U S A. 2001. V. 98. P. 7649-7651.Ruden M., Puri N. Novel anticancer therapeutica targeting telomerase. //Cancer Treatment Reviews. 2013. V. 39. P. 444-456.Chen H., Li Y., Tollefsbol T.O. Strategies targeting telomerase inhibition. //Mol Biotechnol. 2009.
V. 41. P. 194-199.Tominaga T., Kashimura H., Suzuki K., Nakahara A., Tanaka N., NoguchiM., Itabashi M., Ohkawa J. Telomerase activity and expression of humantelomerase catalytic subunit gene in esophageal tissues. // J Gastroenterol.2002. V. 37. P. 418-27.Lü M.H., Liao Z.L., Zhao X.Y., Fan Y.H., Lin X.L., Fang D.C., Guo H.,Yang S.M. hTERT-based therapy: A universal anticancer approach (Review).// Oncology Reports. 2012.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
