Ингибирование теломеразы человека (1105569), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Если влизате присутствует олигонуклеотиды, то они ингибирует и ПЦР, ителомеразнуюреакцию.Темсамымможносудить,проходилолиингибирование теломеразы в клетке или при постановке ТРАП.Мы проанализировали ингибирование шага ПЦР в методе in vivo RQТРАП для некоторых ингибиторных олигонуклеотидов, введенных в клеткиHEK293E при максимальной использованной ранее концентрации 10мкМ (табл.7).
Видно, что ни один из этих олигонуклеотидов не ингибирует ПЦР ителомеразу in vitro. На основании этого можно предположить, что этиолигонуклеотиды успевают деградировать в клетке до проведения анализа invitro. Эффект ингибирования теломеразы в методе in vivo ТРАП обусловленсобытиями, происходящими внутри клетки.Табл. 7.Проверка ингибирования ПЦР в in vivo ТРАП.олигонуклеотид активность,%*с3N95.0±3.4с3M88,7с3J87.3±9.9Nc3M102.6±13.4Jc3N85±9.5Nmisc3J94±2.6Nmisc3Jmis109.1±3.4compNc3J100±20M*c3M95.5±14.7832.2.3.2. Стабильность химерных олигонуклеотидов в клеточных линиях изащита 5’-концаНа данный момент не существует корректных универсальных методовопределения стабильности олигонуклеотидов в клетке.
В основном остабильности олигонуклеотидов судят по функциональному анализу. Известно,что олигонуклеотиды могут деградировать как внутри, так и с 3’- и 5’-конца. С3’-конца мы защитили олигонуклеотиды аминолинкером и исследовалистабильность, связанную с 5’-концом. Олигонуклеотиды Mc3N* и M*c3Nингибируюттеломеразуодинакововусловияхinvitro.Впервомолигонуклеотиде оба 5’-конца не защищены, во втором защищены полностью.Соответственно в условиях in vivo их ингибирующие активности различаются в10 раз.
Существует корреляция между защитой 5’-конца и ингибирующейспособностью в условиях in vivo (рис. 35). Тот же эффект проявляется дляолигонуклеотида Mc3M (табл. 6).Наиболеесильныйэффектпризащите 5’-конца проявляетсянаолигонуклеотиде М. В условиях in vitro разницы в ингибировании между c3M иМс3 не было. Однако в условиях in vivo IC50 для 5’-защищенного с3Мсоставляет 5,2 нМ, тогда как для 5’-незащищенного Мс3 – 175 нМ, что даетразличие больше, чем в 30 раз.
Для химерных олигонуклеотидов это отличиесоставляет всего 3-4 раза. Возможная причина заключается в том, чтохимерные олигонуклеотиды состоят из 2-х частей и 5’-защита во второмолигонуклеотиде сильно замедляет деградацию. Однако для олигонуклеотидовNc3J и N*c3J ингибирующие эффекты были одинаковы. Это может бытьобъяснено худшей ингибирующей способностью N*c3J по сравнению с Nc3J.84Рис.
35. Корреляция числа незащищенных 5’-концов и ингибированиятеломеразы.Дляпредставлениябылииспользованыхимерныеолигонуклеотиды, составленные из М и N частей: Mc3N* (количество 5’незащищенных концов – 2), Mc3N и Nc3M (количество 5’-незащищенныхконцов – 1), M*c3N и c3Mc3N (количество 5’-незащищенных концов – 0).2.2.3.3.
Длина и расположение линкераДляисследованиявлияниядлинылинкеранаингибирующуюспособность кроме химеры Mc3N, были синтезированы олигонуклеотиды,соединенные через триэтилен и гексаэтилен гликоль. MNc3 был использованкак контроль с нулевой длиной линкера. Во всех олигонуклеотидах 5’-конец незащищен.Результатыпредставленына рис.36. Полученные данныепоказывают, что длина линкера между олигонуклеотидами не влияет на ихингибирующую способность.85Присутствие линкера с 5’-конца уменьшает IC50 в 10 раз (рис. 36).Линкер в этом случае выступает в качестве защиты 5’-конца и препятствуетполной деградации химерного олигонуклеотида.25IC50,nM20151050Nc3MРис.36.ВлияниеNc9M8N1cMдлиныMc3NлинкераNM3cипозициивхимерныхолигонуклеотидах на ингибирование теломеразы in vivo.2.2.3.4.
Специфичность химерных олигонуклеотидовХимерные олигонуклеотиды ингибируют теломеразу в условиях in vivoнамного эффективнее, чем в in vitro (табл. 6). Известно, что 2’-алкилмодификация олигонуклеотидов увеличивает их специфичность [168]. Однаконаше подозрение в специфичности вызвали химерные олигонуклеотидысостоящие из N и J частей. Так как в условиях in vitro эти олигонуклеотиды неингибируют теломеразу, тогда как в системе in vivo сравнимы с остальнымихимерными олигонуклеотидами.86Для проверки специфичности ингибирования в условиях in vivo за счеткомплементарности олигонуклеотида были введены нуклеотидные замены вкаждую часть химеры Nc3J (Nmisc3J, Nc3Jmis, Nmisc3Jmis) (табл.
6),нарушающиетакоевзаимодействие.Количествонуклеотидныхзаменсоставило 5-6 на каждую часть. Корреляция количества замен и ингибирующейспособностеи оказалось линейной (рис.37). Возможно, есть и другиемеханизмы, по которым действуют эти химерные олигонуклеотиды, так какпоказано, что введения всего двух нуклеотидных замен для 2’-алкилмодифицированныхолигонуклеотидовспоследовательностьюCAGUUAGGGUUAG достаточно для уменьшения ингибирования теломеразы в1000 раз [118].
Замена N и J частей в Nc3J химере на комплементарные(compNc3compJ) (табл. 6) привела кполной потере ингибирующейспособности в условиях in vivo. Это говорит о том, что ингибирующий эффект,основанный на комплементарных взаимодействиях олигонуклеотидных частейхимер и hTR, присутствует.Рис. 37. Корреляция зависимости ингибирующей способности химерныхнуклеотидоввусловияхнекомплементарных hTR.invivoотчиславведенныхнуклеотидов872.2.3.5. Токсичность химерных олигонуклеотидовДля подтверждения специфичности действия химерных олигонуклеотидовтолько на теломеразу также была проверена токсичность наиболее активныххимерных олигонуклеотидов на клетки HEK293E методом МТТ (рис.
38), таккак ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vivo можетбыть обусловлено их цитотоксическим действием. В случае M*c3N и N*c3J(рис. 38 Д и Е) виден незначительный спад выживаемости. Он начинается сконцентрации 10 нМ и не доходит до 50%.
Однако эти олигонуклеотидыснижают теломеразную активность наполовину при концентрации менее 1нМ.Следовательно, влиянием токсичности при оценке ингибирования теломеразыin vivo можно пренебречь.2.2.3.6. Уровень теломеразной РНК в системе in vivo в присутствиихимерных олигонуклеотидовИзвестно, что 2’-алкильные олигонуклеотиды не являются субстратом дляРНКзы-Н и не вызывают деградацию РНК мишени. Однако выше мы показали,чтоиз-занедостаточнойспецифичности,возможно,химерныеолигонуклеотиды имеют другие пути ингибирования теломеразы. Один извозможных путей – деградация hTR. В связи с этим мы решили проверитьстабильность hTR в клетках в присутствии химерных олигонуклеотидов.88Рис. 38.
MTT анализ цитотоксичности химерных олигонуклеотидов приразной концентрации на клетках HEK293E. A - M*c3M, Б – c3MN, В- Mc3N, Г –Nc3J, Д – M*c3N, Е – N*c3J.89Количество hTR в клетках HEK293E, культивируемых в присутствииразличных концентрации химерных олигонуклеотидов было измерено методомПЦРреальноговременисобратнойтранскрипцией(RQ-ПЦР)сиспользованием GAPDH мРНК как внутреннего контроля, также как в работе[169]. Для этого из клеток, культивированных в присутствии олигонуклеотидов,получали экстракт. Далее проводили обратную транскрипцию в присутствииэкстракта с последующей ПЦР в реальном времени. Относительное количествополученной hTR нормировалось на количество GAPDH.Для олигонуклеотидов Nc3J, Nmisc3Jmis, Nc3Jmis, c3MN, Mc3N и М*с3Мпри увеличении их концентрации при трансфекции уровень hTR в клеткезначимо не менялся (рис. 39) и не коррелировал с изменением теломеразнойактивности.
Следовательно, химерные олигонуклеотиды не влияют настабильность hTR.2.2.3.7. Сборка теломеразного комплекса в присутствии химерныхолигонуклеотидов в условиях in vivoИз предыдущих данных видно, что химерные олигонуклеотида неингибируют теломеразу за счет деградации hTR и не имеют цитотоксическоговоздействия на клетки. Если эти олигонуклеотды запускают какие-тосигнальные пути, то могут ингибировать теломеразу за счет подавленияэкспрессии или пост-трансляционной модификации hTERT. Однако наиболеевероятный и простой механизм ингибирования теломеразы в клетке возможное назрушение сборки за счет блокирования взаимодействия hTERT иhTR.
Известно, что олигонуклеотиды, не ингибирующие собранную активнуютеломеразу, могут ингибировать ее за счет нарушения сборки теломеразныхкомпонентов [126,136].90Рис. 39. Стабильность теломеразной РНК в условиях in vivo вприсутствии химерных олигонуклеотидов разной концентрации.91Для проверки возможного влияния химер на сборку теломеразы былопроведено центрифугирование в сахарозном градиенте клеточных экстрактов,полученных после трансфекциий клеток олигонуклеотидами, концентрациякоторых была больше, чем IC50. Это привело к разделению собранноготеломеразного комплекса и свободной hTR. Фракции после разделения былисобраны, начиная с более тяжелых.
В каждой фракции было измереноколичество hTR и теломеразная активность. Данные показаны на рис. 40.Рис. 40. Оценка сборки теломеразы. A. Распределение hTR и теломеразнойактивностипофракциямградиента,полученногопослеградиентномцентрифугировании клеточного экстракта HEK293. Б. Распределение hTRпосле градиентного центрифугирования экстрактов полученных из клетокHEK293 и HEK293, трансфецированных M*c3M химерным олигонуклеотидом.В. Количество собранной теломеразы, оставшейся после трансфекциихимерными олигонуклеотидами in vivo.92Для клеток HEK293 пик количества hTR совпадает с пиком теломеразнойактивности (рис. 40A).
Это означает, что этот пик принадлежит собраннойтеломеразе. Для сравнения, распределение hTR для клеток HEK293и клеток,инкубированныхвприсутствииM*c3Mхимеры(наиболеесильныйтеломеразный ингибитор в системе in vivo), показано на рис. 40Б. Видно, чтоколичество hTR сильно уменьшается (до 22%) в пике с собранной теломеразой.Данные для c3J и других эффективных химер Nc3J, M*c3N, c3MNсуммированы на рис. 40C. Все наиболее активные химеры ощутимо влияют насборку теломеразы. Самый сильный эффект показала химера Nc3J, для которойпочти не детектировался собранный теломеразный комплекс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
