Ингибирование теломеразы человека (1105569), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Многиенаходятся на стадии клинических испытаниях, однако их успешность негарантирована. По статистике, только 7% испытываемых онкологическихпрепаратов доходят до одобрения с I фазы клинического испытания и 28% и45% со II и III фазы, соответственно [141], так что шансы на появление нарынке новых препаратов на основе некоторых из теломеразных ингибиторовсуществуют.502. Результаты и обсужденияОсновной задачей работы была разработка новых подходов дляингибирования теломеразы. Самым первым и важным этапом был выборметода исследования.
Для скринига ингибирующей способности веществнеобходим надежный метод тестирования. Самым доступным и простымметодом для исследовании ингибирования теломеразы является ТРАП метод.Однако, как было показано в литературном обзоре, этот метод имеетнедостатки, связанные с ингибированием ПЦР. На данный момент нетуниверсального способа устранения ингибирования ПЦР.2.1. Разработка метода детекции теломеразной активностиВ связи с этим, появилась необходимость по модификации ТРАП дляисследования ингибирования теломеразы веществами различной природы, втом числе олигонуклеотидами.
Существует три важных аспекта для успешнойреализации ТРАП: 1 – чистота теломеразы, 2 – отсутствие ингибирования ПЦР,3 – количественностьанализа. Проблема количественности анализа быларассмотрена в литературном обзоре, она решается с помощью использованияПЦР в реальном времени.2.1.1. Очистка теломеразного экстрактаБольшинство исследователей в качестве источника теломеразы на первомэтапе используют клеточные экстракты. Самым известным является S100экстракт. Для его получения вначале клетки лизируют, полученный лизатцентрифугируют при низких скоростях, обычно это до 16000g.
Это даетвозможность избавиться от клеточного дебриса. Супернатант, полученный51после центрифугирования клеточного лизата, называется S16 экстрактом. ДалееS16 экстракт центрифугируют при 100 000g для избавления от рибосом.Полученный супернатант называется S100 экстрактом [142]. Такой экстрактявляются неочищенным и содержит многочисленные компоненты клетки,средикоторыхестьолигонуклеотидыингибиторыПЦР,(теломеро-подобныйнуклеазы,праймеригидролизующиеингибиторныеолигонуклеотиды) и другие вещества, влияющие на результат ингибированиятеломеразы [143]. Чистота теломеразы зависит от ее источника, чем вышечистота препарата, тем меньше побочных процессов происходит при работе сним.
Обычно для детекции теломеразной активности методом ТРАПиспользуют S100 экстракт. Однако, ДНК и РНК олигонуклеотиды неустойчивыв неочищенных лизатах [144]. Для защиты олигонуклеотидов от действиянуклеаз их обычно модифицируют. Мы проверили устойчивость 3'-NH2защищенногоолигонуклеотида«N»(споследовательностьюGTTGCCCCGGGCCGACCGCG) в S100 экстракте (рис.
22). Для этогоолигонуклеотид «N» инкубировался с S100 экстрактом в солевых условияхтеломеразной реакции в течение разных промежутков времени. В дальнейшемсмесь депротеинизировали и подвергали электрофорезу с последующимокрашиванием SYBR Green I. Оказалось, что олигонуклеотид полностьюдеградирует в течение 60 минут (рис. 22А). Следовательно, использование S100экстракта для анализа олигонуклеотидов как ингибиторов теломеразы методомТРАП неприемлимо.Как было описано в литературном обзоре, самым надежным методомизмерения теломеразной активности является прямой метод детекции. Былопроведено ингибирование теломеразы олигонуклеотидом «N» в прямом методе,в качестве источника теломеразы также был использован S100 экстракт. В этомметодеиспользуютрадиоактивныйнуклеотид, которыйвключаетсяв52теломерный продукт за счет теломеразной реакции.
Полученный теломерныйпродукт анализируют с помощью гель-электрофореза. Длина теломерногосубстрата составляет 18 нуклеотидов, теломераза добавляет на первом шаге 4нуклеотида, а в дальнейшем еще по 6 нуклеотидов. Соответственно длинателомеразного продукта не может быть ниже 22 нуклеотидов. Однако прииспользовании олигонуклеотида «N» появляются сигналы более короткихпродуктов, что свидетельствует о деградации ДНК (рис. 22Б). Следовательно,вместо S100 экстракта необходимо использовать более чистый источниктеломеразы.АБРис. 22. А – Деградация ДНК-олигонуклеотида, защищенного с 3’-концаNH2-группой, в S100 экстракте в зависимости от времени.
Б – ДНКолигонуклеотид «N» защищенный с 3’-конца NH2-группой в прямом методедетекции теломеразной активности в S100 экстракта. Дорожка 1, 2, 3 –олигонуклеотид «N» присутствовал в теломеразной реакции при различнойконцентрации. 4 – отрицательный контроль, в котором отсутствовал S100экстракт. 5 – положительный контроль. Стрелкой отмечены продуктыдеградации.53Основная проблема очистки теломеразы – низкое ее содержание в клетке.На сегодняшний день самый используемый метод очистки теломеразы основанна ее аффинном выделении за счет субстрата теломеразы [145].
Однако элюциятеломеразы со смолы с помощью олигонуклеотида высокой концентрацииделает такой метод очистки не пригодным для измерения ингибированияолигонуклеотидами без дополнительного этапа очистки.АБРис. 23. А – Схема очистки теломеразы методом дифференциальногоцентрифугирования. Б – Схематическое представление глицериновой подушки.54Первой задачей работы стала разработка метода очистки теломеразы. Дляэтого решили использовать метод дифференциального осаждения (рис. 23). Влитературе отсутствуют работы, в которых проводили бы осаждениетеломеразы.Известно,центрифугированиичтотеломеразаперемещаетсясчеловекатироглобулином,приградиентномкоторыйимееткоэффициент седиментации (Сведберга) равный 20.
Исходя из этих данных,используя онлайн калькулятор по подсчету времени седиментаций [146]оценили время необходимое для осаждения. Оно составило примерно 2 часа.На первом этапе выделения теломеразы из клеток (рис. 23) получали S16экстракт, чтобы избавиться от клеточного дебриса и ДНК. После этоготеломеразу очищали от более тяжелых молекул центрифугированием через20% глицериновую подушку получая S100 экстракт (рис. 23Б).
S16 экстрактсодержит 10% глицерина, соответственно, буфер с 20% глицерином имеетбольшую плотность, и молекулы осаждаются в нем медленнее, т.е. в условияхцентрифугирования теломераза остается в 10% глицериновом экстракте, тогдакак более тяжелые молекулы проходят через 20% глицериновую подушку иоказываются в осадке.
Без подушки ~50% теломеразы оказывалось в осадке 2(рис. 26А). На следующем этапе центрифугирования ставилась обратная задача– осадить теломеразу и препятствовать осаждению более легких молекул. Вэтом случае так же подходит 20% глицериновая подушка, однако скоростьосаждения необходимо увеличить до 210000 g.
Почти вся теломеразаоказывалась в осадке 3 (рис. 23А). В дальнейшем этот осадок растворяли в 1xТРАП буфере с 10% глицерином, т.к. он является реакционным притестировании ингибирования теломеразы.Так как теломераза является сложным комплексом, измерение выхода ичистоты полученных препаратов проводили по двум параметрам теломеразы:по активности теломеразы и по количеству теломеразной РНК. Теломеразную55активность измеряли методом RQ-ТРАП, выход по активности считалиделением суммарной активности очищенной теломеразы на суммарнуюактивность S16 экстракта, он составил 55% (табл.3).
Относительное количествоhTR измеряли методом ПЦР реального времени с обратной транскрипцией.Выход по hTR составил 31% (табл. 3). Такое различие в выходах может бытьобусловлено тем, что в ходе очистки теломеразы были удалены еевнутриклеточные ингибиторы, что привело к увеличению ее активности посравнению с неочищенным S16 экстрактом [147].Табл. 3.Параметры очистки теломеразы. Теломеразная активность была измеренаметодом RQ-ТРАП. Относительное количество hTR было измерено ПЦР-омреального времени с использованием обратной транскрипции.белок,µгТеломеразная активностьСумм.уд.актив Фактор Выхактивн,н ОЕ/ µг очист.
од%ОЕ1221100S165.99осадок0.466.6414.43ОЕ – относительные единицы.7.255hTRсуммhTR,U12уд.hTR/U/µг23.738.19Фактор Выхоочист.д%11004.131Фактор очистки активной теломеразы был рассчитан отношениемудельной активности очищенной теломеразы (на единицу массы белка) кудельной активности S16 экстракта и составил 7. Однако по количеству hTRфактор очистки составил 4. Такое различие также можно объяснитьувеличением активности теломеразы из-за очистки от внутриклеточныхингибиторов теломеразы. Для сравнения, фактор очистки при использованииаффинного выделения теломеразы составляет ~70 [145]. В полученном нами56частично очищенном и обогащенном теломеразном экстракте олигонуклеотидоказался устойчивыми в течение 60 минут.
Степень концентрированиятеломеразы предложенным нами методом зависит от объёма растворителя,используемого для растворения осадка 3 (рис. 23А), и не превышает десяти.2.1.2. Устранение ингибирования ПЦРПри скринингах ингибиторов теломеразы методом ТРАП очисткателомеразного продукта перед ПЦР абсолютно необходима, т.к. ингибиторытеломеразы обычно ингибируют и ПЦР.
Теломераза и ДНК-полимеразыявляются полимеразами и имеют сходные структуры. Одной из целей нашейработы было исследование ингибирования теломеразы олигонуклеотидами,которые по своей природе одинаковы с продуктом теломеразы, из-за чегоочистка с помощью депротеинизации/осаждения и/или выделения на spinколонках не подходят.На первом этапе нужно было проверить возможность использованияметода ТРАП. Для оценки ингибирования ПЦР олигонуклеотидами в качествемодельных олигонуклеотидов мы решили использовать РНК олигонуклеотидыHuG2R (5’-UUAGGGUUAGGG-NH2-3’) и HuG4R (5’-(UUAGGG)4-NH2-3’),имеющиетеломерныепоследовательностиимаксимальносхожиестеломерным продуктом.
Из литературных данных известно, что такиеолигонуклеотиды ингибируют теломеразу, т.к. являются аналогами TERRA –природного ингибитора теломераз [148]. Контроль влияния ингибиторов наПЦР проводили, добавляя ингибитор в ПЦР после удлинения субстратателомеразой. Если сигнал будет таким же, как и в отсутствие ингибитора, тоэто означает, что ингибитор не влияет на ПЦР. Результаты представлены нарис.
24. Видно, что РНК-олигонуклеотиды ингибируют ПЦР реакцию (рис. 24,57сравнить дорожки 1 и 2 с дорожкой 3). Следовательно, стадия очисткипродуктов удлинения от тестируемых олигонуклеотидов до ПЦР необходима.1234Рис. 24. Ингибирование ПЦР реакции в ТРАП методе теломерными РНКолигонуклеотидами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
