Ингибирование теломеразы человека (1105569), страница 2
Текст из файла (страница 2)
1, цифра 1), изменение направления сплайсинга мРНК hTERT(рис. 1, цифра 2), деградация транскриптов hTERT и hTR (рис. 1, цифра 3 и 4),ингибирование посттрансляционной модификации (рис.1, цифра 6), а так женарушение сборки теломеразного комплекса (рис. 1, цифра 7), ингибированиеферментативной активности собранного теломеразного комплекса и потеряконцами теломер доступности для взаимодействия с теломеразой (отмечено нарисунке 1 цифрой 8). Созревание первичного транскрипта hTR еще не изучено,поэтому использование этой стадии в качестве мишени не является возможным.11Рис. 1. Общая схема биогенеза теломеразы и уровни воздействия. 1 – ингибирование транскрипции генаhTERT, деградация первичного транскрипта и генная терапия; 2 – перенаправление сплайсинга мРНК hTERT всторону форм, не кодирующих белок; 3 – деградация зрелой формы мРНК hTERT; 4 – деградация первичноготранскрипта hTR; 5 – созревания первичного транскрипта hTR; 6 – пострансляционная модификация ииммунотерапия; 7 – нарушение сборки теломеразного комплекса; 8 – уменьшение доступности концов теломердля теломеразы и ингибирование активной теломеразы.12Недавно ряд ингибиторов теломеразы перешли в стадию клиническихиспытаний, и полученные данные свидетельствуют о перспективностииспользования ингибиторов теломеразы [15].
В данном обзоре нами будетрассмотрено ингибирование работы теломеразы в целом [16], а так жеиммунотерапияигеннаятерапия,нарушениебиогенезателомеразы.Иммунотерапия является на данный момент наиболее успешным подходом.1.2 ИммунотерапияТеломераза является РНК-белковым комплексом, состоящим в основномиз hTERT и hTR. В клетке экспрессия hTERT коррелирует с активностьютеломеразы, тогда как hTR присутствует, предположительно, во всех тканях[17]. В связи с этим hTERT считается наиболее селективной мишенью средивсехкомпонентовтеломеразы.ИспользованиеhTERTкакмишенипредполагает на два подхода: иммунотерапию и генную терапию.Иммунотерапия – это стимуляция иммунной системы пациента для атакиопухолевых клеток.
Иммунотерапия является наиболее успешной из всехразрабатываемых направленных на теломеразу стратегий. Суть методазаключается в том, что используют пептид, несущий часть последовательностиhTERT. В результате активируются CD8+ и/или CD4+ цитотоксические Тлимфоциты(ЦТЛ),специфическираспознающиеhTERT-позитивныеопухолевые клетки. Были выявлены более 30-ти последовательностей пептидовиз hTERT, вызывающих иммунный ответ как in vitro, так и in vivo [18],наиболее успешными и известными из них оказались GRNVAC1 и GV1001[19].
Основными задачами при разработке таких пептидов - являетсяувеличениеихиммуногенностииподавлениеиммунологической13толерантности к пептиду, т.к. антигены hTERT для человеческого организмаявляется «своими». В двух вышеприведенных препаратах используются дваразных подхода.GV1001 (KAEL-GemVax Co. Ltd., Gangnam-gu Seoul, Republic of Korea)представляетсобой16-звенныйпептид,имеющийпоследовательностьсоответствующую области 611-626 аминокислот hTERT. Пептид используетсявместе с адъювантами, такими как гранулоцит-моноцит стимулирующийфактор или толл-подобный рецептор 7. Это предотвращает быструюдеградацию пептида до его распознования антиген-представляющей клеткой иусиливает иммуногенность пептида [19]. После более чем 8-ми летклинических испытаний I/II фазы был сделан вывод, что GV1001 необходимоиспользовать в комбинации с химиотерапией, т.к.
сам по себе GV1001 недостаточно эффективен [20,21]. Однако последние клинические испытания IIIфазы этого препарата совместно с применяемыми химиотерапевтическимипрепаратами (гемцитабин и капецитабин) не показали эффективность GV1001[22].В организме пациента может содержаться несколько и/или множествоэпитопов ЦТЛ против hTERT. Препараты, основанные на введении пептида,могут активировать только один из эпитопов ЦТЛ, тем самым вызывая толькомоноклональный ответ. Для активации различных эпитопов ЦТЛ противhTERT можно использовать дендритные клетки. Известно, что дендритныеклетки являются наиболее сильными антиген представляющими клетками ипродуцируетантигеныдляширокогокругаглавногокомплексагистосовместимости (MHC) [23], тем самым вызывая поликлональный ЦТЛответ.Использованиедендритныхклетокэлиминируеттестированиеэффективности разных участков hTERT в виде пептида на пациентах.GRNVAC1 терапия заключается в следующем: молодая дендритная клетка14выделяется из крови пациента методом лейкофореза, затем в условиях ex vivo(проведение экспериментов в живой ткани, перенесённой из организма вискусственную внешнюю среду) в клетку вводится мРНК, кодирующая hTERT,и часть лизосомального мембранного белка (LAMP).
Такая модифицированнаяклетка созревает в условиях ex vivo и вводится обратно пациенту [24]. LAMPнеобходим для направления hTERT пептида в лизосому для его деградации испецифической активации CD4+ пути (рис.2А) [25]. CD4+ механизмзаключается в активаций Т-хелперных клеток, которые, в свою очередь,активирует как производство антител, так и ЦТЛ. Такой механизм вызываетболее широкий иммунный ответ по сравнению с CD8+ путем (рис.2Б) [26].AБРис.
2. Механизм действия hTERT-LAMP вакцины. А – внутриклеточныемеханизмы приводящие к активации ЦТЛ. Б – общая схема представлениямеханизма активации ЦТЛ дендритными клетками.Для этой терапии было проведено всего одно клиническое испытание IIфазы, начатое в 2007 год. Была показана эффективность GRNVAC1 (была15достигнута ремиссия у 19 пациентов из 21 с дальнейшим рецидивом), однакодальнейшие исследования были остановлены, возможно, из-за дороговизнытакой терапии [27].Основная проблема иммунотерапии при лечении онкозаболевании,вставшая перед разработчиками нового терапевтического подхода, заключаетсяв сильной зависимости от иммунитета больного.
Некоторые типы опухолевыхклеток, выделяя иммуносупрессоры, подавляют иммунитет и препятствуюттакой терапии [28].1.3. Генная терапияДля генной терапии предполагается использовать искусственный вирус,либо являющийся литическим вирусом, либо содержащий «суицидный» генпод промотором, который специфически активен в опухолевых клетках.Преимуществом генной терапии является быстрая гибель клеток, что былопоказано in vitro [29].
Кроме того, можно использовать несколько промотороводновременно, что показано в работе [30]. Примером может служитьлитический вирус CG5757, который содержит промоторы hTERT и E2F1. E2F1является транскрипционным фактором и активирован в видах опухолей, неэкспрессирующих белок ретинобластомы (т.к. преимущественно находится вкомплексе с этим белком), составляющих 85% всех типов опухолевыхпоражений. Одной из основных проблем генной терапии является доставкавируса во все клетки организм и появление иммунного ответа к вирусу, чтосильно ограничивает использование такого подхода [18].
Первые поколенияаденовирусов создавались неспособными к репликации, чтобы обеспечитьбиологическуюбезопасность.Примеромтакогоаденовирусаявляется16Ad/TRAIL-F/RGD, в котором ген лиганда фактора некроза опухоли, которыйвызывает апоптоз (TRAIL), экспрессируется под hTERT промотором [29].Однако эффект от использования аденовирусов первого поколения оказалсякоротким.Второе поколение аденовирусов имеет индуцированную репликацию вклетках, в которых активен промотор hTERT. Для репликации аденовирусамнеобходимы белки E1A и Е1В, закодированные в гене Е1. Если поменятьсобственный промотр Е1 гена на hTERT промотор, то такой вирус будетреплицироватьсяиубиватьтолькоклетки,экспрессирующиеhTERT.Примером такого вируса является ОВР-301 (препарат под названиемТеломелизин), прошедший I стадию клинического испытания, в котором онпоказал хорошую переносимость [31].
Планируется II стадия клиническогоиспытания в случае гепатокарциномы (опухоль печени) [32]. Успех такогопрепарата связан с тем, что такой полноценно размножающийся вирусоднократно вводился внутрь опухоли. Вирусы размножаются и лизируютопухолевые клетки, новые вирусы преимущественно заражают соседниеопухолевые клетки. Альтернативой распознаванию клеток, экспрессирующихhTERT, рассматривается прямое ингибирование теломеразы.1.4. Ингибирование работы теломеразыТеломераза активна в половых, стволовых и опухолевых клетках. Приингибированийтеломеразыопухолевыеклеткипродолжаютделитьсянекоторое время до критического укорочения теломер, после котороговступают в апоптоз [33]. Период между началом ингибирования теломеразы ииндуцированным укорочением теломер и апоптозом, называют лаг-временем.17Этот период может составить до 100 дней в зависимости от типа клеток [34].Однако, если длина теломер в опухолевых клетках изначально короткая, тоапоптоз наступает раньше, чем у стволовых клеток (рис.3).Рис.
3. Схематическое представление корреляции изменения длинытеломер и биологических процессов.В связи с этим длина теломер опухолевой клетки является основнымкритерием выбора системы для тестирования препарата, ингибирующеготеломеразу [19]. Перед тем как рассматривать и сравнивать различныеингибиторы теломеразной активности необходимо понять, как определяютспособность веществ блокировать работу теломеразы.181.4.1. Методы измерения теломеразной активностиДля исследования ингибирования теломеразы, в первую очередь,необходим надежный метод.
Из-за низкой концентрации теломеразы в клетке(100 молекул на 1 клетку) [35] детекция компонентов теломеразы и ееактивности становится сложным процессом. Первым для исследованиятеломеразы использовался прямой метод детекции теломеразной активности[36]. Этот метод основан на удлинении праймера теломеразой в клеточномэкстракте в присутствии радиоактивно меченого нуклеотида, которыйвключается в теломерный повтор.
Далее продукты удлинения анализируютэлектрофорезом. Этот метод очень надежный, показывает не толькоактивность, но и количество добавленных теломерных повторов. Однако уэтого метода очень низкая чувствительность, из-за чего необходимо большоеколичество теломеразы и радиоактивного материала, что невозможно дляобыденного использования в обычных исследовательских лабораториях [37].1.4.1.1.
ТРАП анализИсследование теломеразы начало бурно развиваться после разработкиметода амплификации теломерных повторов (ТРАП) в 90-е годы прошлогостолетия [38]. ТРАП состоит из 3 основных шагов: удлинение праймерателомеразой, амплификация получившегося продукта (продуктов) и детекция.На шаге удлинения теломерные повторы прибавляютсятеломеразой,присутствующей в клеточном экстракте, к олигонуклеотиду TS (telomerasesubstrate) – теломеразному субстрату. Отличительная особенность этого19праймеравтом,чтооннеимееттеломерныхповторов(5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’), хотя и узнается теломеразой как субстрат.Следующий шаг – увеличение количества продукта с помощью специфическихпраймеров методом ПЦР.
Затем следует детекция, как правило, методомэлектрофоретическогоразделенияипоследующегофотографирования.Получаются полосы, самая нижняя из которых соответствует одномудобавленному теломерному повтору. Следующая полоса соответствует двумдобавленным теломерным повторам и т.д. (рис.4) [39]. Этот вариант считают«классическим» вариантом метода ТРАП.Рис. 4. Схематическое представление метода ТРАП.За счет усиления сигнала методом ПЦР, ТРАП является высокочувствительным методом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
