Ингибирование теломеразы человека (1105569), страница 5
Текст из файла (страница 5)
17. Структура: А – G-квартета, Б – G-квадруплекса.37Соединения, связывающиеся с G-квадруплексами и стабилизирующие их,называются лигандами G-квадруплексов (G4-лиганды). Известно, что 3’-конецтеломеры, свернутый в квадруплекс, не распознается как субстрат длятеломеразы[94].ПоэтомутакиеG4-лигандыблокируютдоступностьтеломердля теломеразы (рис. 1, цифра 8). Основное требование к такимсоединениям – хорошее связывание с квадруплексом (с константой ассоциацийКа порядка 106) и плохое связывание с ДНК дуплексом (Ка~102), т.к.неспецифическое связывание с двухцепочечной ДНК приводит к токсичности[95]. По структурным особенностям G4-лиганды делятся на два вида: 1 –антархинон и акридиновые производные, 2 – полициклические и не слитыециклы. Основная структурная особенность таких лигандов – это наличиегетероциклических ядер, расположенных в одной плоскости, позволяющейреализовать стэкинг взаимодействие с плоским G-квартетом квадруплекса (рис.17А).Известно, что 10% типов опухолевых клеток поддерживают длину теломерза счет альтернативной теломеразе системы, основанной на рекомбинациителомер, минуя активацию теломеразы [96].
Для таких типов опухолевыхклеток мишенью может стать сама теломера. Именно G4-лиганды будутвзаимодействовать с G-богатой цепью теломер. Такие вещества, связываясь стеломерами, как предполагается, нарушают их функцию, тем самым приводя кгибели клеток. На настоящий момент синтезированы и охарактеризованы более1000 G4-лигандов [97].
Однако наиболее известные и изученные G4-лигандыэто BRACO-19, RHPS4, TMPyP4, Quarfloxin, Telomestatin, AS1410 (рис. 18).Первыми открытыми G4-лигандами были антрахиноновые производные.Однако основной недостаток этих соединений – низкая растворимость в воднойсреде. В связи с этим были разработаны двузамещенные акридиновыепроизводные (рис.19) [98]. В этих соединениях атом азота, находящийся в38центре молекулы, протонирован и заряжен при физиологических условиях,поэтому такое соединение более растворимо в водной среде. За счет дефицитаэлектроновватомеазота,находящегосявгетероциклическомувеличивается аффинность к квадруплексу.QuarfloxinТеломестатинBRACO-19AS1410RHSP4TMPyP4Рис.
18. Структурные формулы наиболее известных G4-лигандов.ядре,39Антрахиноновые производныеАкридиновые производныеРис. 19. Структурные формулы двузамещенных антрахиноновых иакридиновых производных.Эти соединения взаимодействуют не только с G4-квадруплексами, но и сдвуцепочечной ДНК. Известно, что двуцепочечная ДНК имеет две бороздки,тогда как у G4-квадруплекса их четыре. Предполагалось, что замещенныегруппы по бокам акридина взаимодействуют с бороздками ДНК (рис. 20). Всоответствии с этим был синтезирован трехзамещенный акридин BRACO-19(рис.
18), который преимущественно взаимодействует с квадруплексом.BRACO-19 сильнее ингибировал теломеразу и имел меньшую токсичность дляклеток (табл. 2) [99].Рис. 20. Схематическое представление взаимодействия акридиновыхпроизводных с двуцепочечной ДНК и G4-квадруплексом. Предполагается, чтобоковые группы акридиновых производных, взаимодействуя с бороздкамиквадруплекса, увеличивают аффинность к нему.40Табл.
2.Сравнение двузамещенного акридина и трехзамещенного BRACO-19.СоединениеКаКадвуцепочечнаяквадруплексДНКIC50, µМтеломеразаIC50*, µМростклеток,клеточнаялинияA2780Двузамещен.1.1x1061.3x1065.22.65акридинBRACO-195.0x1051.6x1070.06>25* - концентрация вещества, при которой время удвоения клетоквозрастает в 2 раза.При культивировании клеточной линии рака шейки матки (UXF1138L),которая имеет очень короткие теломеры (2,7тыс.
п.о.), в присутствии BRACO19 старение клеток начиналось на 15-ый день обработки [100]. Этого временине достаточно для прохождения числа делений, которое бы приводило кзначимому укорочению теломер. Оказалось, что G4-лиганды действуют помеханизму, который активирует ответ на появление двуцепочечного разрыва. Вклетках с теломерой связываются многочисленные белки [101]. G4-лиганды,взаимодействуя с теломерной последовательностью, должны препятствоватьсвязыванию этих белков с ней. Однако, было показано, что суперэкспрессиибелков POT1 и hTERT достаточно для появления у клеток резистентности к G4лигандам [102,103]. На основании этого сделали вывод, что отсутствие hPOT1 иhTERT на теломерах – это признак действия G4-лигандов [95]. СоединениеAS1410 (рис.18) является модификацией BRACO-19.
В нем третья боковаягруппа,состоящаяизанилиновогопроизводного,былазамененанафторпроизводное для уменьшения окисления и улучшения фармакокинетикипрепарата. В результате время полужизни AS1410 была в два раза больше, чем41у BRACO-19 [104], однако противоопухолевые способности не улучшились[93].Quarfloxin (также известный под названием CX-3545), структура которогоприведена на рис.18, является соединением первого поколения G4-лигандов,взаимодействующихклиническихс квадруплексом, и единственным дошедшим доиспытанийцитотоксичностью,[95,105].предположительно,Остальныелигандыобусловленнойобладалинеспецифическимсвязыванием лигандов с двухцепочечной ДНК, и не сооответствали критериям,предъявляемым к лекарственным средствам: эффективное и селективноепроникновение препаратаметаболизм,широкоепроизводнымв опухоли,терапевтическоефлуорохиналона,приемлемаяфармакокинетика иокноQuarfloxinкоторый[95].имееткакявляетсяG-квадруплексстабилизирующие, так и топоизомераза II связывающие свойства.
КомпанияCylene Pharmaceuticals успешно провела модификацию этого соединения,увеличив специфичность к связыванию с G-квадруплексом. Изначальносчиталось, что это соединение будет уменьшать экспрессию онкогена c-myc,связываясь с последовательностью его промотора, содержащий теломерныеповторы. Однако, неожиданно было найдено, что Quarfloxin концентрируется вядрышкеиселективноингибированияпростингибирует–промоторработуполимеразырибосомногоI.Механизмгенасодержитпоследовательность TTAGGG, с которой связывается нуклеолин и активируеттранскрипцию. Quarfloxin, связываясь с этой последовательностью, неподпускает нуклеолин, тем самым транскрипция гена выключается. Свободныйнуклеолин локализуется в нуклеоплазме, что является признаком стрессаклетки и индуцирует апоптоз [106].
Этот препарат участвовал в двухклинических испытаниях II фазы и был изъят. Данные испытаний былизакрыты (номер клинических испытании NCT00780663 и NCT00485966).42Возможные другие уровни воздействия на биогенез теломеразы (рис. 1)менее удачны в плане поиска низкомолекулярных веществ, приводящих кснижению теломеразной активности, так как в этих случаях мишенью восновном являются РНК.
Соответственно, для влияния на эти процессы удобноиспользовать олигонуклеотиды. Преимуществом ингибирования теломеразыолигонуклеотидамиявляетсявозможностьпредварительногодизайнаолигонуклеотидов. Для низкомолекулярных веществ пока такой возможностинет из-за отсутствия модели структуры высокого разрешения теломеразычеловека.1.5.4. Олигонуклеотиды для ингибирования теломеразыОлигонуклеотидыявляютсяэффективнымиинструментамивмолекулярной диагностике [107] и функциональной геномике [108], а главное,рассматриваются,какперспективныетерапевтическиесредства[109].Технологии регулирования клеточных процессов на основе олигонуклеотидовпродемонстрировали свою эффективность in vitro и in vivo [110,111].
Насегодняшнийденьиспользуютсяразличныеподходы:антисмысловаятехнология, РНК-интерференция, аптамеры, анти-микроРНК, CRISPR и другие.Основные проблемы, возникающие при использовании олигонуклеотидов вкачестве терапевтических агентов, сопряжены с их низкой стабильностью invivo и со сложностью их селективной доставки в ткани и клетки [112]. Измногочисленныхисследованныхпотенциальныхолигонуклеотидныхпрепаратов на данный момент всего три одобрено FDA: витравен (1998),макуген (2004), мипомерсен (2013) [113].
Однако более 20-и клиническихиспытаний, находящихся на III фазе, дают надежду широкого внедрениятехнологии. Витравен является фосфоротиоатным олигонуклеотидом, его43производство было прекращено из-за низкого спроса. Другие два препаратаявляются химерными олигонуклеотидами.
Рассмотрим преимущество инедостаткихимическихмодифицированныемодификацийолигонуклеотидыолигонуклеотидов.существенноболееХимическистабильныиэффективнее проникают в клетки при сохранении биологической активности[114]. Присоединение различных лигандов позволяет добиться специфичностидоставки конъюгатов в определенные клетки за счет рецептор-опосредованногоэндоцитоза [115]. При создании олигонуклеотидных ингибиторов теломеразыбыли использованы различные модификации сахаро-фосфатного остова, аименно 2'-O-алкилрибонуклеотиды и олигонуклеотиды с тиофосфатной,фосфамидной и тиофосфамидной межнуклеотидными связями, а такжепептидонуклеиновые кислоты (ПНК) [116] (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
