Ингибирование теломеразы человека (1105569), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Для анализа достаточно от 10 до 1000 клеток.Однако есть работы [40, 41], в которых было показано, что при использованииТРАП в исследовании ингибирования теломеразы in vitro происходит иингибирование ПЦР. Стандартным методом проверки ингибирования ПЦРявляется внутренний контроль (ITAS), это олигонуклеотид не имеющийтеломерной последовательности (рис. 5), который исходно присутствует всмеси и амплифицируется на шаге ПЦР с помощью TS присутствующего в20смеси и дополнительно добавленного NT-праймера. Было показано, что еслиесть вещества, взаимодействующее с теломерной последовательностью, то ониингибируют амплификацию продуктов удлинения теломеразой на шаге ПЦР,но не ингибируют амплификацию ITAS контроля [40,41].Рис.
5. Схематический рисунок, показывающий, что амплификациявнутреннего контроляITAS не ингибируетсятеломер связывающимиагентами, тогда как амплификация теломеразного продукта ингибируется.Необходимо учитывать, что «классический» ТРАП – это полуколичественный метод. Это наглядно видно на примере ингибитора теломеразыBIBR1532 (табл. 1). Ингибирование теломеразы обычно оценивается спомощью IC50 – концентрация ингибитора, при которой активностьтеломеразы составляет 50% от исходной. Наиболее надежный прямой методопределения теломеразной активности дает IC50 в пределах 0,1мкМ, тогда какТРАП с последующим использованием геля для детекции дает IC50 в пределах5мкМ.21Табл. 1.Данные об ингибировании теломеразы (IC50) веществом BIBR1532.Метод измеренияIC50, мкM ссылкапрямой метод~0.1[42]прямой метод0.083[43]TRAP5.62[44]TRAP5-20[41]TRAP5[45]TRAP4.6[46]Такое различие связано с тем, что после усиления сигнала ПЦР в геледетектируется количество амплифицированной ДНК, а ДНК амплифицируетсядо выхода на плато.
При детекции с использованием гель-электрофорезафактически детектируется только плато, что хорошо иллюстрируется кривымиПЦР реального времени (рис. 6). Например, при концентрации 0,1мкМBIBR1532 ингибирует теломеразу наполовину, однако при амплификациителомеразного продукта его количество выходит на насыщение (рис. 6А).Соответственно, при дальнейшей детекции в геле разница между неингибированной теломеразой и наполовину ингибированной будет намногоменьше, чем в 2 раза (рис.
6Б).22Рис. 6. Схематический рисунок, демонстрирующий разницу в детекциимежду RQ-ТРАП (А) и обычным ТРАП (Б). 1 – теломеразная активность вотсутствие BIBR1532, 2 – в присутствии 0,1мкМ BIBR1532, 3 – в присутствии5мкм BIBR1532.Проблема полу-количественности в ТРАП устраняется путем заменышага ПЦР на ПЦР реального времени. Такой метод называется RQ-ТРАП (realquantitative – количественный ТРАП) (рис. 6А) [47]. На данный момент широкоиспользуется два вида RQ-ТРАП основанных на двух разных видах детекции вПЦР: 1) детекция с помощью флуоресцентного красителя SYBR Green I [47], и2)использованиешпилечногоолигонуклеотида,основанноенафлуоресцентном резонансном переносе энергии [48].
В первом случае на шагеПЦР в реакционную смесь дополнительно добавляют SYBR Green I, которыйсвязывается с ДНК ПЦР продукта, тем самым усиливается флуоресценция,которая детектируется прибором. Преимуществом такой детекции являетсянизкая стоимость. Минусом является возможность образования димерапраймеров.SYBRGreenI,неспецифическисвязываясьсовсеми23двуцепочечными ДНК, также детектирует димеры праймеров, если ониобразуются.Во втором случае детекции в ТРАП методе на шаге ПЦР в качествеобратного праймера используется шпилечный олигонуклеотид.
При включениив ПЦР продукт, шпилька разворачивается, тем самым увеличиваетсярасстояние между флуорофором и тушителем, что приводит к появлениюфлуоресценции (рис. 7). Такой шпилечный олигонуклеотид называетсяAmpliFluor-RP. За счет шпилечной структуры обратного праймера образованиедимеров праймеров исключено.Рис. 7. Схематическое представление RQ-ТРАП, в котором используетсяшпилечный обратный праймер AmpliFluor-RP.24Использование ПЦР реального времени сокращает время анализа, т.к. нетнеобходимости проводить гель электрофорез.
Из-за отсутствия электрофорезаRQ-ТРАП является высокоэффективным, может быть автоматизирован ииспользован для скрининга ингибиторов теломеразы.1.4.1.2. Устранение ингибирования ПЦРБольшинстволабораторийдляустраненияингибированияПЦРиспользуют очистку продуктов удлинения теломеразой перед ПЦР. ЕстьнескольковидовочисткипередПЦР:фенольнаядепротеинизацияспоследующим осаждением (Ф/О) [49,50], очистка продуктов удлинениятеломеразой на колонке [51], аффинная очистка [52].При методе Ф/О реакционную смесь после теломеразной реакцииобрабатывают насыщенным раствором фенола для депротеинизации, иосаждают теломеразный продукт. Очищенный продукт удлинения праймерателомеразой подвергают ПЦР.
Такой метод очистки трудоемок и не подходитдля скринингов ингибиторов теломеразы.Очисткапродуктаудлиненияпраймерателомеразойнаколонкезаключается в использовании spin-колонок из оксида кремния. В большинствеслучаев при таком методе необходимо использовать киты для выделения ДНК,что стоит достаточно дорого.Аффинная очистка (рис. 8) продукта удлинения праймера теломеразойсостоит в том, что продукт выделяется с помощью биотинилированногокомплементарного олигонуклеотида b-CCCTAACCCTAA, иммобилизованногона магнитные шарики.
Прогревание до 75°С разрушает комплементарную связьмеждуиммобилизованнымолигонуклеотидомипродуктомудлинения25праймера теломеразой, что позволяет снять его с магнитных шариков. Однакоеслиингибиторытеломеразыспособнысвязыватьсястеломернойпоследовательностью в продукте удлинения праймера теломеразой, то такаяочистка не подойдет.На настоящий момент отсутствует универсальный метод очисткителомеразного продукта, подходящий для всех классов ингибиторов теломераз.Рис. 8.
Схематическое представление аффинной очистки продуктаудлинения праймера теломеразой перед ПЦР шагом.1.4.1.3. «In vivo ТРАП»Измерение теломеразной активности прямо в клетке осуществляется вусловиях in situ [53]. Под названием «in vivo ТРАП» подразумеваетсяманипуляциястеломеразойвклеткеспоследующимвыделением26теломеразного экстракта и проведением ТРАП [54]. Для этого клеткуобрабатывают ингибитором теломеразы и культивируют в течение несколькихдней. Обработанные клетки лизируют и получают экстракт, содержащийтеломеразу.
Далее экстракт анализируют по протоколу in vitro ТРАП (рис.9).Такой метод позволяет учитывать влияние веществ на синтез компонентовтеломеразы, их стабильность, сборку теломеразного комплекса, проникновениевеществ в клетку.Рис. 9. Схематическое представление, демонстрирующее разницу in vivoи in vitro методов ТРАП.1.4.2. Низкомолекулярные вещества и ИметелстатНизкомолекулярные вещества как ингибиторы теломераз обладают рядомпреимуществ. Их производить и транспортировать намного легче, чемантитела, пептиды, ДНК, бактериофаги и т.д., из-за этого их стоимость намногониже.Такжеестьнизкомолекулярныхвозможностьвеществ,модификациичтобыхимическойулучшитьструктурыфармакокинетику,специфичность и т.д.
Порядка 90% лекарственных препаратов на мировомрынкефармакологическихвеществами [55].препаратовявляютсянизкомолекулярными27Так как теломераза по своей природе относится к классу ферментовобратных транскриптаз, в первую очередь в качестве ингибиторов теломеразыбыли протестированы ингибиторы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).Такие соединения уже протестированы в клинических испытаниях и былиодобрены министерством здравоохранения и социальных служб США,занимающимся контролем качества пищевых продуктов, лекарственныхпрепаратов (FDA), в качестве лекарственных средств.
Наиболее известные изних – это AZT и TDG-TP (рис.10) [56].AZT был протестирован in vitro на клеточных линиях, и было показаноингибирование теломеразы. TDG-TP показал более сильное ингибированиетеломеразы (IC50=60нМ) [57]. Однако дальнейшее использование этих веществкак противоопухолевых препаратов не произошло, т.к. нет корреляции ихприменения в клинике со снижением числа онкологических заболеваний убольных синдромом иммунодефицита (СПИД) [58-61].Рис. 10.
Структурные формулы AZT и TDG-TP.Одним из самых известных низкомолекулярных ингибиторов активнойтеломеразы является BIBR1532 (рис. 11), который считается первымдействующим по не-конкурентному механизму в in vitro условиях, с IC50равной 93 нM [43]. Однако при культивировании клеток в присутствии28BIBR1532 и измерении теломеразной активности в клеточном экстракте егоингибирующая способность оказалась в 50 раз ниже [45]. Вывод авторов [43] онеконкурентноммеханизмеингибирования,возможно,неявляетсяправильным, так как они применили уравнение Михаэлиса-Ментен длярасчетов. Известно, что система, не подчиняющиеся уравнению МихаэлисаМентен, всегда показывает не конкурентное ингибирование при использованииэтого уравнения. Например, известно, что теломераза человека в условиях invitro является димером [62], а димерные ферменты не подчиняются уравнениюМихаэлиса-Ментен [46].Рис. 11.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
