Ингибирование теломеразы человека (1105569), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Дорожки 1 и 2 – добавление HuG2R и HuG4R в ПЦРреакцию,соответственно.Дорожка3–ПЦРвотсутствиеРНК-олигонуклеотидов. Дорожка 4 – негативный контроль.Метод очистки теломеразного продукта за счёт аффинного выделения спомощью иммобилизованного комплементарного олигонуклеотида (см. литобзор, стр.
24-25) также не подходит, т.к. такое выделение проводят прикомнатной температуре, и наши исследуемые олигонуклеотиды могут совыделяться за счет образования квадруплексов или комплементарноговзаимодействия с иммобилизованным олигонуклеотидом.Известно, что любые активные вещества, например, яды (а такжеингибиторы, ферменты, катализаторы и т.д.) имеют предел допустимойконцентрации (ПДК) действия, ниже которого перестают действовать [149].58Чтобы решить проблему ингибирования ПЦР, мы добавили этап разбавлениятеломеразного продукта после проведения реакции удлинения перед ПЦР.
Приразбавлении можно снизить концентрацию ингибиторов ниже ПДК иингибиторы перестают ингибировать ПЦР. При этом в ПЦР теломеразныйпродукт амплифицируется.Основным параметром исследования ингибирования теломеразы в этойработе являлось IC50. Для его расчетов необходим количественный методдетекции. В связи с этим был использован RQ-ТРАП, т.е. ТРАП сиспользованием ПЦР реального времени (рис. 25Б), в котором ПЦР продуктдетектируется с помощью краски SYBR Green I, интеркалированный в него.Во-первых, был построен калибровочный график (рис.
25А). Для егополучения использовали олигонуклеотид TSR8 [150] имеющий 8 теломерныхповторов и имитирующий теломеразный продукт (рис.25 Б). Эти данныеиспользовали для количественной оценки теломеразной активности. Передиспользованием разбавления для исключения ингибирования ПЦР необходимобыло убедиться, что разбавление теломеразного продукта не повлияет налинейность сигнала от количества материала.
Результат опыта представлен нарис. 25В. Видно, что при 2-х кратном серийном разбавлении продуктовтеломеразной реакции линейность зависимости сигнала от количествателомеразного экстракта сохраняется.IC50 рассчитывается по логарифмической кривой ингибированиятеломеразы.
Для этого измеряли относительную теломеразную активность вприсутствии разной концентрации ингибитора и строили график (рис. 26), дляправильного расчета IC50 необходимо выявить его верхний и нижний пределы,т.к. ингибирование ПЦР не должно начаться до достижения нижнего платоингибирования теломеразы (рис. 26А)..59AБВРис. 25. Линейность сигнала от олигонуклеотида TSR8 (А) и теломеразы(В) в ТРАП методе с использованием разбавления. A – Калибровочная кривая иБ – Оригинальная кривая амплификаций, полученных при 10-кратномразбавлении TSR8. В – Проверочная кривая, полученная путем двухкратногосерийного разбавления теломеразного экстракта.60Адо разбавленияпосле разбавленияБРис. 26. Разбавление теломеразного продукта.
А – схематическоепредставление графика ингибирования теломеразы до и после разбавлениятеломеразного продукта перед ПЦР. Б – график ингибирования теломеразыолигонуклеотидами HuG2R и HuG4R измеренный методом RQ-ТРАП.Ингибирование теломеразы отмечено как (•), ингибирование ПЦР как (Ο).При проверке ингибирования ПЦР ингибиторы были добавлены послетеломеразной реакции перед разбавлением и ПЦР. После разбавлениятеломеразного продукта кривая ингибирования смещается (рис. 26А)Разбавление теломеразного продукта в 40 раз решило проблемуингибирования ПЦР для РНК олигонуклеотидов (рис.
26Б). В случае HuG4R61видно,чтоприувеличенииконцентрацииолигонуклеотидначинаетингибировать ПЦР уже в отсутствие теломеразного продукта.Таким образом, измерить ингибирование теломеразы олигонуклеотидамиили другими веществами, влияющим на ПЦР, без выделения продуктовудлинения теломеразой можно с помощью введения дополнительного шагаразбавления после теломеразной реакции до усиления сигнала ПЦР.2.1.3. Проверка метода на низкомолекулярных G4-квадруплекслигандахАдекватность предложенного подхода проверили, используя соединенияс известным IC50, определенным ранее другими методами.
Для этого выбралинизкомолекулярноесоединениеBIBR1532.ЕгоIC50составило0,214±0.038мкМ, что намного лучше соответствует результатам измеренияпрямым теломеразным методом (IC50~0,1мкМ), чем обычным ТРАП методом(IC50 4-5мкМ) (см. литобзор стр.21).Однако известно, что BIBR1532 не ингибирует ПЦР [41]. Чтобыпроверитьвозможность использованияингибиторовПЦР,являющихсяметода дляG4-лигандами,низкомолекулярныхпроверилиизвестныесоединения ингибирующие теломеразу, LCTA-1120 и LCTA-1581 [151] (табл.4). Другие производные антрахинонового ряда (табл.
4) были синтезированы влабораторииН.С.Ильинского–сцельюулучшенияихспособностивзаимодействовать с G4-квадруплексами [152]. Большинство соединенийингибирует ПЦР в пределах концентрации 0,05-0,15 мкМ, тогда как теломеразув 4-7 раза слабее (табл. 4). Использование 2000 кратного разбавленияполностью элиминирует влияния ингибиторов на ПЦР. По полученным даннымвидно, что модификация боковых групп не сильно влияет на способностьингибировать теломеразу.62Табл .4.Названия, IC50 ингибирования теломеразы и структурные формулыантрахиноновых производных.НазваниеIC50, мкMIC50, мкMсоединенийтеломеразаПЦРСтруктурная формулаHN1794HNOLCTA-17940,47±0.14NH0,27±0,072HClSHNOOLCTA-20820.49±0.26NHNH2HN2082HNNHOне опред.HNHNHNO0,63±0.24NH2NHне опред.2HClNH2102LCTA-21023HClNH218150.57±0.21NHNHNHNH2HNNHSOLCTA-1815NHOHNOHNNHNH2NHHNNH2NH0,3±0,072HClSHNONH2413OLCTA-24130,68±0.25NH2HN0,36±0,27OS3HClNHNHNHOHN1120HNOLCTA-11200,69±0.240,45±0,142HClSHNO1816LCTA-18160.71±0.21ONHHNHN2HClOHNONHNHHN21060.72±0.23NH2NHне опред.OLCTA-2106NH2NH2HNHNNH2NH2NH0,070±0,0452HClSOHNNH2632100LCTA-21000.83±0.23OHNHN0,098±0,0562HClSOHNNH2HN1581OLCTA-15810.92±0.452HClSO3±0.92±0.7HN2HClNH2HNNHONH2ONH2NHSONH2HCl0.5±0.3S2097LCTA-2097HN33±232096LCTA-2096NH2NHS209310±2NHHN0,049±0,026OLCTA-2093NH2NH21031.1±0.5HN0,075±0,08OLCTA-2103NH2NHOHNOHNNHNHHNNH2NH2NH0.9±0.3HClSONH22.1.4.
Ингибирование теломеразы новым металлорганическимсоединением, содержащим медьРазработанный нами метод был дополнительно протестирован на новомметаллорганическом соединений. Открытие цисплатина привело к ростуисследований в области применения металло-лекарств в противоопухолевойтерапии. Из не-платиновых соединений большой интерес вызывают соединениямеди, т.к. ее координационные свойства хорошо изучены, а также показано, чтоцитотоксичность некоторых металлорганических соединении меди обусловленамеханизмами активации апоптоза [153].
Для более широкого изучения медныхкомплексов на кафедре органической химии химического факультета МГУ в64лаборатории профессора Зыка Н.В. в группе Мажуги А.С. было синтезированоновое соединение 2-алкилтио-5-арилметилен-4H-имидазолин-4-он (рис. 27А),которое образует комплекс с двумя атомами меди в двух разных степеняхокисления (рис. 27Б). В дальнейшем соединение вне комплекса с медью будемназывать «лиганд».
Нами было протестировано ингибирование теломеразылигандом и его комплексом.ONSNSNNNNАOБРис.27. Структурная формула 2-алкилтио-5-арилметилен-4H-имидазолин4-он (А) и его комплекса с медью (Б). R – заместитель аллильного радикала.Этот комплекс (рис. 27Б) ингибировал теломеразу с IC50 13 мкМ по ТРАПметоду (табл. 5) и с IC50 20мкМ по прямому методу детекции теломеразнойактивности (рис. 28). Такое различие в результатах можно объяснить разнымиспособами, например, различные количества используемой теломеразы вметодах, разные субстраты, разные солевые условия в теломеразной реакции ит.д.
Однако возник вопрос о степени стабильности комплекса в разных солевыхусловиях. Для этого решено было проверить ингибирует ли теломеразу лигандсам по себе и двухвалентная медь. Оказалось, что двухвалентная медьингибирует теломеразу с IC50 равной 9мкМ. Лиганд без меди такжеингибирует теломеразу на том же уровне, что и комплекс (табл.
5). Можно65сделать предположение, что расположение меди в комплексе критически невлияет на ингибирующую способность соединения. Кроме того, полученныеданные говорят о необходимости подтверждения ингибирующей способностивыбранныхпорезультатамRQ-ТРАПсоединенийпрямымметодомопределения ингибирования теломеразы.Табл.
5.Ингибирование теломеразы комплексным соединением 2-алкилтио-5арилметилен-4H-имидазолин-4-он. Данные получены методом RQ-ТРАП.соединениеIC50,мкMлиганд12±6лиганд +CuCl2(комплекс)CuCl213±29±1Рис. 28. Результаты прямого метода тестирования теломеразнойактивности при исследовании ингибирования теломеразы комплексом лиганда2-алкилтио-5-арилметилен-4H-имидазолин-4-он с медью.662.1.5. Рекомбинантная экспрессия теломеразы и вальпроевая кислотаНедостаток использования разбавления для исключения ингибированияшага ПЦР в методе ТРАП исследуемыми веществами заключается в том, чтопри сильном разведении концентрация теломеразного продукта становитсяменьше предела чувствительности ПЦР, врезультате на шаге ПЦР непроисходит амплификация теломеразного продукта.
В связи с этим необходимоповышать концентрацию теломеразного продукта. Для этого необходимоповысить концентрацию теломеразы в теломеразной реакции, т.к. изначальноконцентрации теломеразного субстрата (TS) и нуклеотидов заведомо выше, чемтеломеразы.Решаетсятакаяпроблемапутемувеличенияколичествотеломеразы в клетке. Это возможно за счет рекомбинантой экспрессиителомеразы исходно в клетке перед получением теломеразного экстракта.
Наданный момент в мире для увеличения экспрессии теломеразы в основномиспользуетсягенно-инженернаяконструкция,созданнаявлабораториипрофессора Лингнера [154]. В этой конструкции два компонента теломеразыhTR и hTERT синтезируются с двух разных плазмид. В одной кДНК hTR подпромотором U1 встроена в вектор pBluescript II, в другой кДНК hTERTвставленаввекторpcDNA6/myc-HisC.Этиплазмидытранзитарноэкспрессируются в клетках HEK293Т с течением времени. Основная проблемапри транзитарной экспресии – уменьшение транскрипции трансфецированныхплазмид в клетке во времени. Основными механизмами уменьшениятранскрипции являются метилирование ДНК и деацетилировании гистонов[155,156]. Одним из способов борьбы с этим явлением является использованиеингибиторов этих процессов.
Ингибиторы деацетилаз гистонов хорошоизвестны. Один из эффективных ингибиторов деацетилаз – это вальпроеваякислота (ВПА) [155]. Мы проверили транзитарную экспрессию теломеразы в67присутствии и отсутствие ВПА. В наших условиях добавление ВПА увеличиловременную экспрессию теломеразы в 2 раза (рис. 29). При использовании ВПАмы наблюдали остановку деления обработанных клеток.Рис. 29. Увеличение экспрессии теломеразы с помощью добавления ВПА.«+» - трансфецированные в клетки HEK293T плазмидами профессора И.Лингнера.
«-» - не трансфецированные клетки.Вторым способом борьбы с уменьшением транскрипции генов наплазмидах, внесенных в клетку, является эписомальная репликация плазмиды.Известно, что ДНК-содержащие вирусы умеют реплицироваться в клетке.Такие вирусы кодирует белок, который специфически связывается сориджином репликации вируса и привлекает репликативную машину клетки.Разработанная в лаборатории профессора Лингнера система экспрессиителомеразы основана на использовании клеток HEK293T, которые являютсясублинией клеток HEK293, и экспрессируют SV40-антиген вируса SV40.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
