Ингибирование теломеразы человека (1105569), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Структурная формула BIBR1532.Тестирование BIBR1532 на клеточных линиях не оправдало себя.Критическое укорочение теломер наблюдалось только после 120 днейинкубации для клеточной линии немелкоклеточного опухоля легких (NCIH460) [43]. Дальнейшие испытания были остановлены, так как такой долгий лагответ неприемлем для последующей разработки терапевтических препаратов.Было обнаружено, что заведомо высокие концентрации этого веществаселективно цитотоксичны для клеток лейкемии, таких как острый миелоидныйлейкоз и хронический лимфолейкоз [63].Geron и другие компании проскринировали миллионы низкомолекулярныхсоединений, однако специфичного и нетоксичного ингибитора теломеразы небыло найдено [32].29На данный момент единственным успешным проектом прямогоингибированиятеломеразыявляетсяпрепаратИметелстат(GRN163L),разработываемый компанией Geron.
Иметелстат (GRN163L) – олигонуклеотиддлиной13нуклеотидов,имеющийтио-фосфороамидатныйостовипальмитиновую кислоту на 5’-конце последовательности TAGGTGTAAGCAA(рис. 12). Липидная модификация увеличивает проницаемость олигонуклеотидав клетку, однако уменьшает ингибирующую способность. Показанная на рис.12 модификация была выбрана в соответствии с наилучшим эффектом припроникновении в клетку и с наименьшим уменьшением ингибирующейспособности [64].
Это соединение ингибирует теломеразу за счет связывания сматричным участком hTR, тем самым блокируя работу каталитическойсубъединицы теломеразы (рис. 13).Рис. 12. Структурная формула Иметелстата.30Рис. 13. Схематическое представление ингибирования теломеразычеловека препаратом Иметелстат (GRN163L). Иметелстат, связываясь сматричным участкомhTRза счет комплементарноговзаимодействия,блокирует его.
Это препятствует удлинению и повторному взаимодействиютеломеры и теломеразы.В 2005 году после до-клинических испытаний были начаты клиническиеиспытания GRN163L, которые доказали хорошую фармакокинетику ифармакодинамику, эффективность и безопасность препарата [65]. В 2010 годуGeron инициировал II фазу клинических испытаний на немелкоклеточном ракелегких[66],злокачественнойопухолимолочнойжелезыитромбоцитемии/истинной полицитемии (Т/ИП).
В первом случае Иметелстат непоказал достаточного эффекта. В случае с опухолью молочной железы,Иметелстат показал обратный эффект (выживаемость среди пациентов,принимавших Иметелстат, была ниже, чем в контрольной группе). В связи сэтим осенью 2012 года корпорация Geron объявила, что прерывает этииспытания [67]. Известно, что одним из побочных эффектов Иметелстатаявляется тромбоцитопения, которая усиливает эффект терапии противопухолевых клеток крови [68]. В связи с этим единственным многообещающимнаправлением использования Иметелстата является клиническое испытание набольных миелофиброзом, начатое в 2012 году. Было уже объявлено о полномисцелении одного из больных [69].31способенGRN163Lобразовыватьквадруплексвблизкихкфизиологическим условиям.
Предполагается, что этот квадруплекс состоит изпараллельновзаимодействующихчетырехмолекул.Параллельностьобусловлена гидрофобным взаимодействием между липидными хвостами,которое также стабилизирует квадруплекс [70]. Таким образом, препарат можетвытитровывать белки, взаимодействующие с квадруплексами, и иметьпобочные действия. Кроме антителомеразной активности GRN163L влияет нацитоскелет клетки, тем самым изменяя морфологию.
Такая активностьассоциируется с образованием квадруплекса, так как олигонуклеотид, которыйсодержит нуклеотиднуюзамену инеимеетGGGмотива(5’-Palm-TAGGTGTAAGCAA), не влияет на морфологию клеток [71]. Также сталоизвестно, что GRN163L уменьшает экспрессию кадгерина и матрикснойметаллопротеиназы-2,метастазированиякоторыеопухолевыхнеобходимыклеток[72].Этодляещеангиогенезаиразоговоритперспективности использования GRN163L в качестве хорошего дополнения кдругим противоопухолевым препаратам.В процессе разработки Иметелстата были найдены альтернативныекандидаты.
Изначально при скринировании пептидных олигонуклеотидов(ПНК) для блокирования матричного участка hTR были выявлены двепоследовательности с одинаковой длиной 5’-CAGTTAGGGTTAG-3’ и 5’TAGGGTTAGACAA-3’, комплементарные к участкам hTR 46-58 и 42-54,соответственно,эффективноингибирующиетеломеразу.Ингибирующиеспособности теломеразы как в системе in vitro [73], так и in vivo на клеточныхлиниях [74] для обеих последовательностей одинаковы.
Олигонуклеотид,комплементарный к участку 42-54 hTR, в последующем модифицировался допрепарата Иметелстат, тогда как олигонуклеотид, комплементарный к участку3246-58 hTR, несущий 2’-метоксиэтил и фосфоротиоатные модификации,превратился в ISIS24961.Былопоказано,укорачиваетдлинучтоингибиторныйтеломернаолигонуклеотидмодельныхсистемахISIS24961онкологическихзаболеваний у мышей [75]. Однако дальнейшие исследования пока непроведены. Еще одним альтернативным GRN163L олигонуклеотидом является«Т-олиго», который имеет последовательность 5’- GTTAGGGTTAG-3’ и на двануклеотида короче, чем ISIS24961, механизм его действия не определен [76].Изучение уже найденных прямых ингибиторов теломеразы позволяет сделатьвывод о перспективности разработки препаратов, ингибирующих теломеразу.1.5.
Ингибирование биогенеза теломеразыВ клетках активная теломераза появляется в результате сложногопроцесса,обьединяющегосинтез,процессингисборкукомпонентовтеломеразы. В связи с этим мишенями для ингибирования теломеразы могутбыть не только компоненты теломеразы, но и процессы синтеза и сборки этогокомплекса (рис.1). Однако необходимо учитывать, что механизмы биогенезателомеразынедоконцаизучены.Наданныймоментотсутствуютцеленаправленно разработанные и ингибирующие биогенез теломеразы,дошедшие до клинических испытании на человеке, препараты.
Оказалось, чтосуществует очень многолекарственных препаратов, в том числе ипротивоопухолевых, которые ингибируют биогенез теломеразы.1.5.1. Ингибирование транскрипции hTERTЭкспресссия мРНК hTERT характерна для опухолевых клеток [77], тогдакак роста экспрессии hTR нет. В связи с этим считается, что экспрессия hTERT33является основным механизмом регуляции теломеразы, поэтому транскрипцияобратнойтранскриптазытеломеразы–привлекательнаямишеньдляингибирования теломеразы. Последовательность, необходимая для активностипромотора hTERT, имеет длину порядка 200 п.о.
и GC-богата (рис.14).Рис. 14. Схематическое представление промотора hTERT. На рисункеприведены сайты посадки транскрипционных факторов. Участок промотора от+1 до -181 является важным для его активности. ERE – сайт посадки эстрогена[78].Промотор hTERT регулируется различными факторами, однако особоевнимание исследователей привлекает онкогенный фактор Myс. Экспрессия Mycкоррелирует с экспрессией теломеразы, также промотор гена Myc содержиттеломерную последовательность. Неудивительно, что ингибиторы Myc, такиекак бутеин [79], гамбийская кислота [80], генистеин [81] (рис.15), такжеприводят к снижению количества теломеразы в клетке.
Белок Sp1 вместе с Mycинициируеттирозинкиназтранскрипцию–иматиниб,hTERT[82].дасатиниб,Соответственно,нилотинибингибиторы(рис.15)снижаюттранскрипцию hTERT через уменьшение соотношения Sp1/Sp3 факторов [83].Также известно, что эстроген активирует теломеразу, соответственно,антагонист эстрогена под названием тамоксифен ингибирует теломеразу[84,85].
Следовательно большинство противоопухолевых препаратов, кромесобственных мишеней, действуют и на транскрипцию hTERT.34Гамбииская кислотаРомидепсинДасатинибВорнистатНилотинибБутеинИматинибГенистеинРис. 15. Структурные формулы некоторых известных низкомолекулярныхвеществ, ингибирующих теломеразу через репрессию гена hTERT.351.5.2. Ингибирование посттрансляционной модификации hTERTИзвестно,чтотеломеразнаяобратнаятранскриптазаhTERTфосфорилируется и это необходимо для активности и клеточной локализациителомеразы [86]. Следовательно, фосфатазные и киназные ингибиторы могутнепосредственно влиять на теломеразу.
Например, окадаевая кислота (рис. 16)является ингибитором фосфатазы 2А. Известно, что фосфатаза 2А ингибируеттеломеразу. Обработка клеточной линии опухоли молочной железы окадаевойкислотой приводила к активации теломеразы [87].Окадаевая кислотаБисиндолилмалеимидВортманинGö6976Рис. 16. Структурные формулы веществ, ингибиторов фосфатазы (верхнийряд) и тирозинкиназ (нижний ряд).Протеин киназа С (РКС) увеличивает теломеразную активность внекоторых типах опухолевых клеток.
Использование ингибитора этогоферментабисиндолилмалеимида(рис.16)привелокингибированиютеломеразы в клетках назофарингиальной карциномы [88]. В работе [89]36показали ингибирование теломеразы в клетках нескольких клеточных линияхопухолей шейки матки после их обработки препаратом Gö6976 (рис.16),который также являющимся ингибитором РКС. Известный препарат Иматиниб(Гливек),являющийсятеломеразнуюингибиторомактивностьитирозинкиназ,пролиферациютакжеклетокуменьшаетэкспрессирующихтеломеразу [90].Еще одним ферментом, участвующим в пострансляционной модификацииhTERT, является АКТ-киназа.
Это киназа не только участвует в активациителомеразы, но и, фосфорилируя серин в 227-ом положении, определяетлокализацию hTERT в ядре [91]. Ингибирование этой киназы неспецифичнымингибитором киназ – вортманином (рис. 16) привело к ингибированиютеломеразы в клетках [92].1.5.3. Уменьшение доступности теломер для теломеразыОтличительная особенность ДНК теломер в том, что она G-богата исостоит из повторяющихся последовательностей, за счет чего нуклеотиды Gнаходятся на одинаковом расстоянии друг от друга. Это позволяетодноцепочечному концу теломер образовывать G-квартеты (рис.17А) и Gквадруплексы (рис.17Б) [93].Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
