Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение (1105561), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Для получения люциферазы GLuc вструктуру RLuc были введены две дополнительные мутации Y35N и S398M, что привело ксмещению максимума биолюминесценции в зеленую область. Ранее были получены мутантныеформы люциферазы дикого типа с единичной мутацией Y35N [172] и с мутацией S398M [171],для которых наблюдался спектр биолюминесценции с λmax = 550 нм. Мы ввели эти мутации вRLuc и получили термостабильный мутант люциферазы с λmax в желто-зеленой области спектра.При выборе акцептора мы руководствовались следующими критериями: высокийкоэффициент экстинкции, высокий квантовый выход, максимальный интеграл перекрыванияспектра поглощения красителя и эмиссии люциферазы, а также растворимость в воде ивозможность биоконъюгации.
Среди большого количества красителей мы рассмотрели те,которыеобладаютвысокимзначениеминтегралаперекрываниясоспектрамибиолюминесценции люциферазы (Рис. 33). В основном это производные родамина, такие какTexas-Red и ROX, либо их более новые аналоги (Alexa Fluor, DyLight, HiLyte Fluor),обладающие улучшенной стабильностью, меньшей pH- чувствительностью и более высокимквантовым выходом флуоресценции. Их спектральные характеристики представлены в Таблице15.100Alexa Fluor598Texas redGLuc80I, %RoxTexas RedCy 3,560Cy 3.5RLucAlexa Fluor 610-x40Alexa Fluor610-xRLucGLuc20Alexa Fluor 5980500550600650700λ, нмРис. 33.
Спектры биолюминесценции «красной» (Gluc) и «зеленой» (RLuc) форм люциферазыи спектры поглощения красителей97Среди представленных красителей в особенности стоит отметить краситель Alexa Fluor610-x, который имеет два максимума поглощения при 550 и 612 нм, близкими к максимумамбиолюминесценции для GLuc и RLuc соответственно, что обеспечивает оптимальный интегралперекрывания спектров биолюминесценции и поглощения красителя для обеих формлюциферазы.Таблица 15. Характеристики акцепторов для BRET- переносаКрасительλmaxпоглощенияλmaxфлуоресценциεКвантовыйвыходРастворимостьи1Texas red59261085 0000.9Вода, ДМСО,ацетонитрил2HiLyte™ Fluor 59459361680 0000.9ДМФА, ДМСО3DyLight 59459361880 0000.5ДМФА4Alexa Fluor 59459061792 0000.66Вода, ДМСО5Cy3.5580594116 0000.15ДМФА, ДМСО6ROX-6575602107 0001ДМСО, ДМФА,метанол,хлороформ7Bodipy 581/591580590136 000-ДМСО, ДМФА8Alexa Fluor 610-x612628144 0000.66Вода, ДМСОСогласно данным, приведенным в Таблице 15 можно сделать вывод, что красители 1-4при практически идентичных спектральных характеристиках обладают более низкимкоэффициентом экстинкции, по сравнению с красителями 5-8.
Все перечисленные красителирастворимы в органических растворителях, и только красители Alexa Fluor, содержащие в своейструктуре сульфогруппу, растворимы в воде, что в нашем случае является преимуществом,поскольку для антител реакцию конъюгации предпочтительнее проводить в водной среде.Таким образом, в качестве акцептора был выбран краситель Alexa Fluor 610-x (Рис. 34)обладающий оптимальным интегралом перекрывания спектров биолюминесценции обоих формлюциферазы и поглощения красителя, необходимый для эффективного BRET, высокимкоэффициентом экстинкции и более высоким квантовым выходом флуоресценции посравнению с цианиновыми красителями, использованными в работе [161].98CH3H3CCH3N+ONCH3H3CCH3OOO-SNSClOOOOO-OO-NHOSClOOClРис.
34. Структурная формула красителя Alexa Fluor 610-xСпектры поглощения и флуоресценции красителя, а также спектры биолюминесценцииGLuc и RLuc показаны на Рис. 351,0214I, отн. ед.0,80,630,40,20,0500550600650700, нмРис. 35. Нормированные спектры: 1- спектр биолюминесценции люциферазы GLuc, 2спектр биолюминесценции люциферазы RLuc, 3- спектр поглощения красителя Alexa fluor 610х, 4- спектр флуоресценции красителя Alexa fluor 610-х при λ возб 610 нмПоскольку величина BRET-сигнала определяется как отношение интенсивностисвечения в максимуме спектра флуоресценции акцептора к интенсивности в максимумебиолюминесценции донора, для RLuc величину BRET-сигнала находили как I630/I590, а для GLucкак I630/I550. Для правильного определения величины BRET- сигнала немаловажное значениеимеет величина остаточной биолюминесценции донора в максимуме флуоресценции акцептора,которая в данном случае выступает как фоновый сигнал.
Для мутанта RLuc характерно высокое99значение биолюминесцентного сигнала в максимуме флуоресценции акцептора (57% отмаксимального сигнала), а для мутанта GLuc биолюминесцентный сигнал при 630 нмсоставляет всего 15% от максимальной интенсивности биолюминесценции люциферазы.Следовательно, для мутанта GLuc фоновая интенсивность биолюминесценции при 630 нм,почти в 4 раза меньше (Таблица 16).Таблица 16.
Спектральные характеристики мутантов люциферазы L. mingrelica.икрасителяЛюциферазаλmax, нмI630/IλmaxSперекр/Sбиолюм люц, %RLuc5900.5778.5%GLuc5500.1583.7%Где λmax - длина волны, при которой наблюдается максимум биолюминесценции люциферазы,I630/Iλmax - отношение интенсивности биолюминесценции при длине волны испусканиякрасителя Alexa fluor 610-х (630 нм) к максимальной интенсивности, Sперекр/Sбиолюм - отношениеинтеграла перекрывания спектра биолюминесценции люциферазы со спектром поглощениякрасителя к интегралу спектра биолюминесценции.4.4.2.Получение и свойства конъюгатов люцифераза-прогестеронПолучениеконъюгатовлюцифераза-прогестерон(Luc-Pg)проводилипутемвзаимодействия аминогрупп люциферазы и карбоксильной группы производного 3-Окарбоксиметилоксимапрогестерона(3-CHO-Pg),активированногодициклогексил-карбодиимидом и гидроксисукцинимидом. Схема синтеза представлена на Рис.
36На первой стадии проводили активацию 3-О-карбоксиметилоксима прогестерона вдиметилформамиде(ДМФА)путемдобавлениядициклогексилкарбодиимидаиN-гидроксисукцинимида с последующей инкубации реакционной смеси в течение 4 ч прикомнатной температуре и умеренном перемешивании, затем в течение ночи при +4°С. [200].На второй стадии получали конъюгаты Luc-Pg. Для этого к 100 мкл Luc (1 мг/мл) вбуферном растворе добавляли 10 мкл активированного прогестерона в ДМФА (различныеконцентрации), инкубировали, отделяли конъюгат Luc-Pg от низкомолекулярных компонентовна микро-биоспин-колонке с носителем G-25.100A.OH3COH3CCH3CH31)NCCH3NCH3OOOOONONOH2)O+N OHOOOB.NH CNNHOH3CCH3OH3CCH3OOH2NCH3LucCH3ONOONOON+HONHLucONOРис.
36. Схема синтеза конъюгатов Luc-Pg3-О-карбоксиметилоксим прогестерона плохо растворим в воде, поэтому реакциюконъюгации проводили в водно-органической среде (ДМФА/буферный раствор PBS).Предварительный эксперимент показал, что при содержании ДМФА 10% по объему и менеебиолюминесцентная активность люциферазы практически не изменяется, в то время как вприсутствии 30% ДМФА активность фермента уменьшается более чем в два раза (Рис. 37)3,5I·10-6, RLU32,521,510,500102030405060Концентрация ДМФА, %об.Рис. 37. Активность люциферазы после инкубации в буферном растворе PBS, pH 7,8 при+4°С в течение 2 ч в присутствии различных концентраций ДМФА.
Концентрация фермента 1мг/мл.Таким образом, для конъюгации был использован буферный раствор люциферазы сконцентрацией 1 мг/мл, содержащий 10 %-й ДМФА, для которого было показано, что за 120минут инкубации (время проведения реакции) при +4 °С, инактивации люциферазы, вызваннойприсутствием ДМФА, не происходит.101На поверхности молекулы люциферазы находится около 12 доступных аминогрупп. Прииспользовании различного соотношения Luc:Pg в реакционной смеси могут образовыватьсяконъюгаты, содержащие различное количество молекул Pg, связанных с одной молекулойлюциферазы и обладающие различной биолюминесцентной активностью. Для определенияусловий получения конъюгатов оптимального состава конъюгацию проводили при различныхмолярных соотношениях люцифераза: прогестерон (Luc:Pg = 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:60).Согласно литературным данным, для конъюгации прогестерона с пероксидазой хренаиспользовали 0,01 М боратный буфер (рН 8,6) [200], однако конъюгация люциферазы вборатном буфере приводила к значительной потере биолюминесцентной активности фермента.При соотношениях Luc:Pg в реакционной смеси 1:10, 1:20, 1:40 сохранялось 30 ± 5%, 20 ± 5% и10 ± 5% от активности исходной люциферазы соответственно.
Замена боратного буфера на0,01 М PBS (pH =7,8) привела к сохранению более высокой биолюминесцентной активностилюциферазы в составе конъюгатов Luc-Pg. Для этих же соотношений биолюминесцентнаяактивность конъюгатов составила 40±5%, 35±5%, 25±3% соответственно (Рис. 38).120100I, %80PBS60PBSS402001:401:201:101:00Соотношение Luc: PgРис. 38. Зависимость активности конъюгатов GLuc-Pg от молярного соотношения Luc:Pgв реакционной смеси в отсутствие и в присутствии субстратов.
Условия конъюгации: буферныйраствор PBS или PBSS (PBS+10 мМ MgSO4+ 2 мМ ATP), pH 7,8, 1 мг/мл GLuc, 0°С, 2 чинкубации.Согласнолитературнымданным,добавки субстратов впроцессе конъюгациипредохраняют активный центр фермента от химической модификации [75]. В нашем случае,добавление субстрата ATP и MgSO4 в насыщающих концентрациях (2 мМ ATP 10 мМ MgSO4вреакционной смеси), позволило почти в 2 раза увеличить биолюминесцентную активностьконъюгатов по сравнению с конъюгатами, полученными без добавления ATP и MgSO4 (Рис.38).
Для дальнейших исследований конъюгаты получали в присутствии субстратов в102реакционной смеси. Таким образом, были разработаны следующие оптимальные условияполучения конъюгатов Luc-Pg: буферный раствор PBSS, pH 7,8, 1 мг/мл люциферазы, 0°С, 2 чинкубацииДля RLuc и GLuc были получены конъюгаты при различном избытке прогестерона иизмерены биолюминесцентная активность и способность прогестерона в составе конъюгатовсвязываться с антителами. Как показано на Рис.
39, биолюминесцентная активность конъюгатовубывает с возрастанием избытка Pg в реакционной смеси, как для мутанта GLuc, так и длямутанта RLuc. При соотношении Luc:Pg = 1:10 и 1:5 конъюгаты сохраняли 80%биолюминесцентной активности, при соотношении 1:20 - около 70%, при соотношении 1:40 и1:60 - 60% и 55% соответственно.120100I, %8060Gluc40Rluc2001:601:401:201:101:051:00Соотношение Luc: PgРис. 39. Зависимость биолюминесцентной активности конъюгатов GLuc-Pg и RLuc-Pg отмолярного соотношения Luc:Pg в реакционной смеси. Условия конъюгации: буферный растворPBSS (PBS+10 мМ MgSO4+ 2 мМ ATP), pH 7,8, 1 мг/мл люциферазы, 0 °С, 2 ч инкубацииПолученные конъюгаты были проанализированы на способность прогестерона в ихсоставе образовывать специфический комплекс с антителами методом гетерогенного ИФА.Анализ включал в себя следующие стадии: 1) адсорбция конъюгатов на поверхностиполистирольного планшета, 2) инкубация адсорбированного конъюгата с антителами кпрогестерону, 3) инкубация с антивидовыми антителами, мечеными пероксидазой хрена, 4)колориметрическаядетекцияполученногоспецифическогокомплекса.Результаты,представленные на Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
