Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение (1105561), страница 21
Текст из файла (страница 21)
27A,при 37 °С равновесие устанавливается через 1 час, в то время как при 25 °С для этого требуется90 минут, а при 4 °С более 90 минут. При этом отношение фонового сигнала к специфическомуне зависит от времени и температуры инкубации (Рис. 27Б), поэтому для дальнейшихэкспериментов инкубацию проводили при 37 °С в течение часа.АБ50124012345686412330фон, %I.10-5, RLU.1020102000204060время, мин80100020406080100время, минРис. 27. Зависимость биолюминесцентного сигнала в присутствии (рис.
А. кривые 1-3) иотсутствии определяемой ДНК (рис. А. кривые 4-6) и сигнала фона в % (рис. Б.) от времениинкубации образца с раствором Luc-SA при различных температурах. 1- 37 °С, 2 - 25 °С, 3 - 4°С. Условия: Luc-SA 1 нМВ разработанных оптимизированных условиях (указаны в подписи к Рис. 28) былаполучена зависимость биолюминесцентного сигнала от концентрации определяемой ДНК вдиапазоне концентраций от 1,4 до 26 нг /лунка при концентрациях Luc-SA 3,3 и 1 нМ.9120121I.10-5, RLU152105002468101214161820222426[ДНК], нг/лункаРис.
28. Зависимость биолюминесцентного сигнала от концентрации определяемой ДНКпри концентрациях Luc-SA, нМ 3,3 (кривая 1) и 1 (кривая 2). Условия: 30 мкл раствора зонда сконцентрацией 0,3 мкМ, 100 мкл Luc-SA в буфере PBST-BSA, инкубация с Luc-SA 60 мин при37 °С и перемешивании 180 об/мин.Согласно данным, представленным на Рис.
28, минимальная определяемая концентрацияДНК в оптимизированных условиях составила ~ 4 нг/лунку при обеих концентрациях Luc-SA.Несмотря на оптимизированные условия проведения анализа, наблюдается довольно высокоезначение фонового сигнала, обусловленного неспецифической сорбцией Luc-SA. Для снижениянеспецифической сорбции, возникающей за счет гидрофобных взаимодействий междумолекулами гибридного белка и полистиролом, был использован плюроник, преимуществакоторого описаны выше.Поверхность полистирольного планшета покрывали плюроником, иммобилизоваликонтрольные ДНК-зонды и проводили анализ ДНК в условиях описанных выше.Согласно полученным данным (Рис. 29), использование плюроника с последующейобработкой планшета с иммобилизованными зондами раствором BSA-казеин снижаетнеспецифическую сорбцию в присутствии некомплементарного нуклеотида в 5 раз, а безобработки BSA-казеином в 10 раз.
При этом наблюдается лишь незначительное уменьшениебиолюминесцентного сигнала (в 1,6 раза).92700600I·10-3, RLU500400300200NHCPHC1000плюроникАплюроник сBSA-казеинБBSA-казеинВРис. 29. Биолюминесцентный сигнал для ДНК-контролей, иммобилизованных наповерхности полистирола, обработанной плюроником (А, Б) и не обработанной плюроником(В). После иммобилизации зондов поверхность была обработана BSA-казеином в случае Б и В.Условия те же, что на Рис.
28, концентрация Luc-SA 1 нМ.Далее в идентичных условиях были получены калибровочные кривые зависимостибиолюминесцентного сигнала от концентрации определяемой ДНК при двух концентрацияхLuc-SA 1 и 3 нМ при различных способах обработки планшета: 1) обработка раствором BSAказеин, 2) раствором плюроника, 3) раствором плюроника и раствором BSA-казеин послеиммобилизации олигонуклеотидных зондов.Сравнение кривых 1-3 на Рис.
30, показывает, что для полистирольной поверхности,обработанной раствором BSA-казеин, в указанном диапазоне концентраций наблюдаетсявысокий фоновый сигнал, и биолюминесцентный сигнал практически не зависит отконцентрации определяемой ДНК (кривая 3). Для поверхности, обработанной плюроником ираствором BSA-казеин, фоновый сигнал снижается в 4,5 раза, а для поверхности обработаннойплюроником в 10 раз.
При этом значительно возрастает чувствительность анализа. Формакривых для концентрации Luc-SA 1 и 3 нМ была практически идентична.Таким образом, при использовании плюроника нет необходимости в дополнительнойобработке раствором BSA-казеином, что значительно сокращает время подготовки планшета.Для дальнейших экспериментов использовали только обработку плюроником.93А.Б.4007235012363300I.10-3, RLUI/I0, отн. ед.5432101234150100350512001[ДНК], нг/лунка22500,00 0,1123110[ДНК], нг/лункаРис.
30. Зависимости отношения специфического к фоновому биолюминесцентногосигналу (в отсутствие определяемой ДНК) (А.) или интенсивности биолюминесценции (Б.) отколичества ДНК. Использовали полистирольный планшет, обработанный растворамиплюроника и BSA-казеин (кривая 1), плюроником (кривая 2) раствором BSA-казеин (кривая 3)при концентрации Luc-SA 3 нМ.Далее мы оптимизировали концентрацию Luc-SA для достижения наилучшейчувствительности анализа. Для этого получили зависимости биолюминесцентного сигнала (Рис.31) в зависимости от концентрации определяемой ДНК при различных концентрациях Luc-SA(0,1; 0,3; 1 или 3нМ). Согласно полученным данным (Рис.
31), калибровочные кривые имеютпрактически идентичную чувствительность при концентрациях ДНК ниже 1,5 нг/лунка. Приболее высоких концентрациях максимальной чувствительностью обладает кривая, полученнаяпри концентрации Luc-SA 3 нМ, для которой наблюдается линейная зависимость сигнала отсодержания определяемой ДНК в интервале от 0 до 4,5 нг/лунка. Важно отметить, что пределобнаружения ДНК при использовании планшета, обработанного плюроником, снизился в 10 разпо сравнению с результатами, полученными с использованием планшета, обработанногораствором BSA-казеин, и составил ~0,4 нг/лунку.
Таким образом, использование плюроникапозволило увеличить чувствительность испецифичность анализа за счет минимизациинеспецифических взаимодействий между гибридным белком и поверхностью планшета.В результате проведенной оптимизации методики были разработаны следующие условиядетекции ДНК, меченной биотином, с использованием гибридного белка Luc-SA: зондиммобилизовали на поверхности планшета, обработанного раствором, содержащим 10 мг/млплюроника; объем раствора зонда составлял 30 мкл с концентрацией 0,3 мкМ; объем раствораLuc-SA - 100 мкл с концентрацией 3 нМ в буфере PBST-BSA, время инкубации с Luc-SA 60 минпри 37 °С и перемешивании (180 об/мин).946I/I0, отн.
ед5433 нМ1 нМ0,3 нМ21012345[ДНК], нг/лункаРис. 31. Зависимости отношения специфического к неспецифическому сигналу I0 (I0 –сигнал, полученный в отсутствие ДНК) от содержания ДНК при различных концентрациях LucSA. Использовали полистирольный планшет, обработанный плюроником. Концентрации LucSA составили 3; 1; 0,3 нМ соответственно.В оптимизированных условиях мы сравнили калибровочные кривые, полученные водинаковых условиях с использованием люциферазной и пероксидазной меток. Для этогоиспользовали конъюгат пероксидазы со стрептавидином.7HRP-SALuc-SA6I/I0, отн.
ед543210012345[ДНК], нг/лункаРис. 32. Зависимости отношения специфического сигнала к фоновому сигналу отколичества определяемой ДНК с использованием конъюгата пероксидазы со стрептавидином(кривая HRP-SA) и люциферазы (кривая Luc-SA).КакпоказанонаРис.32,методыопределенияДНКсиспользованиемколориметрического и биолюминесцентного методов детекции имеют практически одинаковуючувствительность.
Предел обнаружения с использованием обоих меток составляет 0,4 нг/лунка.95Тем не менее, использование гибридного белка Luc-SA предпочтительно посравнению схимическими конъюгатами HRP-SA.Таким образом, была разработана методика определения ДНК клеток E. coliбиолюминесцентным методом, была показана возможность успешного использованиягибридного белка люцифераза-стрептавидин для анализа ДНК.
Показано, что обработкаполистирольной поверхности плюроником способствует снижению неспецифической сорбциигибридного белка Luc-SA и увеличению чувствительности анализа.4.4. Иммуноанализ прогестерона на основе биолюминесцентногорезонансного переноса энергии (BRET) с использованиемлюциферазы светляков Luciola mingrelicaВ данной главе рассмотрены результаты, показывающие возможность использованиялюциферазы светляков L. mingrelica в гомогенном иммуноанализе на основе BRET дляопределения низкомолекулярных антигенов. В качестве модельного антигена был использованпрогестерон.Система включала термостабильную люциферазу, химически конъюгированную спрогестероном (донор), и антитела, ковалентно связанные с красителем (акцептор).В отсутствие антител наблюдался спектр биолюминесценции люциферазы.
Придобавлении окрашенных антител, происходило образование специфического комплексаконъюгата люцифераза-прогестерон с окрашенными антителами, в котором реализовалсяBRET, сопровождающийся уменьшением интенсивности биолюминесценции люциферазы ипоявлением спектра флуоресценции красителя. В связи с этим BRET-сигнал рассчитывали какотношение интенсивности свечения в максимуме спектра флуоресценции акцептора кинтенсивности в максимуме биолюминесценции донора. При добавлении свободногопрогестерона, конкурирующего с конъюгатами люциферазы за центры связывания антител,BRET-сигнал уменьшался пропорционально увеличению концентрации прогестерона.4.4.1. Конструирование системы для эффективного BRETКак было описано в литературном обзоре, для высокой эффективности резонансногопереноса энергии в первую очередь необходим высокий квантовый выход донора.
Этомутребованию всецело отвечает люцифераза светляков L. mingrelica, которая, как и другиелюциферазысветляков,обладаетнаиболеевысокимквантовымвыходомсредибиолюминесцентных систем, а также немаловажное значение имеет доступность люциферазыL. mingrelica в препаративных количествах, ее высокая каталитическая активность итермостабильность [172, 180]. Поэтому в качестве донора биолюминесценции былииспользованы два термостабильных мутанта люциферазы L. mingrelica: «красная» форма96(RLuc) с максимумом биолюминесценции при 590 нм и «зеленая» форма (GLuc) с максимумомбиолюминесценции при 550 нм (Рис. 33). Люцифераза RLuc была получена и охарактеризованав нашей лаборатории по методу, описанному в [180].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
