Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение (1105561), страница 17
Текст из файла (страница 17)
В лунки планшета симмобилизованными антителами вносили 100 мкл раствора Luc-Pg в PBST-BSA, добавляли 10мкл Pg в буфере PBST-BSA и инкубировали в течение часа при комнатной температуре иумеренном перемешивании (120 об/мин). Затем промывали 4 раза по 200 мкл PBST, добавляли100 мкл субстратной смеси ATP-LH2, предварительно разбавленной в 2 раза буфером PBST ирегистрировалибиолюминесцентныйсигналнаприбореSpectramaxM5врежимебиолюминесценция.714. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕОсновной задачей данной работы являлось создание высокоспецифических реагентов наоснове люциферазы светляков Luciola mingrelica, позволяющих существенно расширитьобласти ее применения в биоспецифическом анализе.
Были разработаны как генноинженерныеконструкции, в которых к молекуле люциферазы методами генетического конструирования былприсоединен белковый фрагмент, способный связываться с изучаемой мишенью [86, 117-120],так и химические конъюгаты люциферазы с молекулами, обладающими специфическойактивностью.Среди систем, в которых можно использовать подобные реагенты, содержащие вкачестве метки люциферазу светляков, особый интерес представляют системы на основевысокоаффинных биотин-стрептавидиновых взаимодействий, которые выступают в качествемостика между изучаемой мишенью и молекулой люциферазы.
Для этих целей были созданыплазмиды, кодирующие гибридные белки стрептавидин-люциферазы и люциферазу сбиотинсвязывающим доменом (bccp) [177], позволяющим получать биотинилированнуюлюциферазу in vivo.4.1. Получение и свойства гибридного белка люциферазы сбиотинсвязывающим доменом (bccp)4.1.1. Конструирование плазмидыКак было описано в литературном обзоре, гибридные белки люциферазы светляков сbccp известны для Photinus pyralis и Luciola lateralis. В данной работе была получена плазмида,кодирующая гибридный белок люциферазы светляков Luciola mingrelica, содержащий на Cконце дополнительно 87 С-концевых аминокислотных остатков биотин-связывающего доменаE.
coli (bccp), которые достаточны для биотинилирования гибридного белка in vivo [120]. Вкачестве люциферазы был использован высокоактивный термостабильный мутант TSлюциферазы светляков L. mingrelica [176].Для получения плазмиды, кодирующей гибридный белок Luc-bccp, были использованытри фрагмента ДНК:1)экспрессионный вектор pET23b, позволяющий проводить экспрессию генагибридного белка с помощью высокоэффективной системы pET [178] и добавляющийшестигистидиновую последовательность на C-конец фермента для его последующей очисткиметодом металлохелатной хроматографии;2)ген термостабильного мутанта люциферазы TS, полученный из плазмиды pETL7[176];723)фрагмент ДНК, кодирующий 87 С-концевых аминокислотных остатков bccp [177],выделенный из генома клеток E.
coli и модифицированный введением сайтов рестрикции SalI иApaI при помощи ПЦР.При конструировании гибридного белка стартовый кодон метионина в начале гена bccpбыл заменен на лейцин, чтобы удалить возможную рамку считывания. Этот остаток находитсяв неконсервативной подвижной петле до начала структурированной части bccp, поэтому егозамена не оказывает существенного влияния на свойства белка [185]. Следует отметить, что вполученной конструкции (Рис. 12 Б) последовательность SGPLEAPAAAEISG выполняет рольподвижного линкера между структурированными частями люциферазы и bccp [186].T7 promoterXho I (500)lucLucpETL7bccp 6Luc-bccp-His5510 bpApa I (1755)bccp87Pst I (3328)termblaC-his-tagHis6LucbccpMASK...SGPLEAPAAAEISG...VIEGVEH6Рис.
12. A. Плазмида, кодирующая ген биотинилированной люциферазы. Б. Схемааминокислотной последовательности Luc-bccpДля наработки полученной плазмидойLuc-bccp-His6 (Рис. 12) были использованыклетки XL1-blue. Секвенирование подтвердило отсутствие мутаций на участке, кодирующемгибридный белок.4.1.2. Свойства гибридного белка люцифераза-bccpДля наработки целевого белка клетки E. coli штамма 21(DE3) были трансформированыполученной плазмидой. Количество белка во фракциях определяли спектрофотометрически(λ=280). Удельная активность очищенной гибридной люциферазы составила 3,5×1012 RLU/мг, аактивность мутанта TS, не содержащего домен bccp, - 6,8×1012 RLU /мг.
Таким образом,активность белка, содержащего bccp-домен, составила 52% или 60% с учетом увеличениямассы гибридного белка до 71 кДа по сравнению с 62 кДа у исходной люциферазы. Уровеньэкспрессии сохранился на том же уровне, что и у исходной люциферазы 23 ± 0,5 мг/мл.73Определение степени биотинилирования гибридного белка.
Для определения степенибиотинилированиягибридногобелкаиспользовалимагнитныечастицы,покрытыестрептавидином. Содержание SA на поверхности частиц рассчитывали согласно инструкциипроизводителя,исходяизтого,что1мгчастицспособносвязать400пмольбиотинилированного белка. Соотношение Luc-bccp:SA на поверхности частиц составило 1:40.Для контроля неспецифического связывания использовали исходную люциферазу Luc, несодержащую bccp-домен. Полученные данные представлены в Таблице 12.Таблица 12. Определение степени биотинилирования.
Состав реакционной смеси:6,02×10-5 мг/мл Luc-bccp или Luc, 0,1 мг/мл BSA, 0,1 мг/мл частиц.Исходная биолюминесцентнаяактивность, %Биолюминесцентная активностьсупернатанта после инкубации счастицами, %Биолюминесцентная активностьсвязавшегося с частицами фермента, %Luc-bccpLuc100 ± 6100 ± 638 ± 294± 562± 35± 0,7Согласно полученным данным, если предположить, что гибридный белок удерживаетсявкомплексесбиотинилированиечастицамигибридногозасчетбелкабиотин-стрептавидиновыхсоставляетпорядка60±взаимодействий,5%сучетомто5%неспецифической сорбции.
В нашем случае наблюдалось неполное биотинилирование,поскольку выращивание клеток велось без добавления экзогенного биотина. Для увеличениявыхода биотинилированного гибридного белка в работе [120] было предложено добавлениебиотина в питательную среду для выращивания клеток в концентрации 10 мкг/мл, чтоувеличивало выход биотинилированного гибридного белка с 55 до 95%, однако в нашем случае,добавление биотина в той же концентрации не увеличило процент биотинилированной формы.Это можно объяснить высоким уровнем экспрессии гибридного белка и более низким уровнемэкспрессии биотинлигазы [113].Белковый электрофорез для Luc-bccp, проведенный в денатурирующих условиях (Рис.13) показал наличие bccp-домена в молекулах гибридного белка, которое проявляется впоявлении полосы, соответствующей белку с массой около 75 кДа и отсутствии полосы смассой, характерной для исходной люциферазы без bccp-домена (62 кДа).
Из представленногорисунка можно также сделать вывод и о высокой степени чистоты белка, полученного послеметаллохелатной хроматографии.74Рис. 13. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях. a-маркер, b-Luc-bccp, c-исходнаялюцифераза Luc.Кинетические характеристики, термостабильность гибридного белка и спектрыбиолюминесценции. Были измерены константы Михаэлиса по каждому из двух субстратов вбуфере AB (рН 7,8) при концентрации белка 0,01 мг/мл. При определении KmLH2 концентрацияATP составляла 1,2 мМ, а при определении Km по ATP концентрация люциферина составляла0,15 мМ. Кинетика термоинактивации гибридного белка, в концентрации 0,01 мг/мл былаизучена при 47°C рН 7,8 в буфере TB1.
Из зависимости Imax от времени инкубации, былопределен период полуинактивации (τ1/2) для Luc-bccp и Luc. Были сняты спектрыбиолюминесценции и определены λmax. Полученные данные представлены в Таблице 13.Таблица 13. Физико-химические свойства исходной люциферазы светляков Luciola mingrelica(Luc) и гибридного белка Luc-bccp.ФерментKm, мкМпо LH2по ATPМаксимумбиолюминесценции,(pH 7.8)λmаx, нмПолупериод инактивациипри 47°,(рН 7.8)τ1/2, минLuc60 ± 541 ± 8590±512 ± 3Luc-bccp66 ± 641 ± 7590±512 ± 3Результаты, представленные в Таблице 13, показывают, что введенный bccp-домен неоказываетвлияниянакинетическиесвойства,спектрыбиолюминесценцииитермостабильность люциферазы.Таким образом, была впервые сконструирована плазмида клонированием генавысокоактивного и термостабильного мутанта люциферазы Luciola mingrelica, содержащегополигистидиновую последовательность, с биотинсвязывающим доменом.
Был впервые получени охарактеризован гибридный белок указанного мутанта люциферазы с биотинсвязывающим75доменом, биотинилированным in vivo, обладающий высоким уровнем экспрессии, высокойлюциферазной активностью и способностью связывать стрептавидин. Таким образом,полученный гибридный белок Luc-bccp может быть использован для детекции аналитов,содержащих стрептавидин, либо для анализа биотинилированных анализируемых веществ всоставе нековалентного комплекса гибридного белка Luc-bccp со стрептавидином.4.2. Получение и свойства гибридных белков люциферазы сострептавидином4.2.1.
Конструирование плазмидДля получения стрептавидин-люциферазы были сконструированы четыре плазмиды.Использовали ген термостабильной люциферазы TS Luciola mingrelica (Luc) [176] иминимальный участок гена стрептавидина (119 а.к.), который клонировали с помощьюполимеразной цепной реакции (ПЦР), используя в качестве матрицы ДНК Streptomyces avidinii.При этом либо к С-концу, либо к N-концу стрептавидина, в зависимости от структурыполучаемой плазмиды, были добавлены последовательности, кодирующие полипептиды,которые в данном случае выполняли функцию подвижных линкеров.
Плазмиды различалисьвзаимным расположением генов Luc и SA. Так плазмиды 1, 2, 3 содержат ген SA на N-концегена Luc, а плазмида 4 - на C-конце. Плазмиды различались также положениемполигистидиновой последовательности: плазмиды 1 и 2 содержат полигистидиновуюпоследовательность на С-конце гена Luc, а 3 и 4 на N- и С-конце SA.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
