Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение (1105561), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Наличие высокого биолюминесцентного сигнала показывало, чтособлюденыусловияиммобилизациизондаигибридизациискомплементарнымолигонуклеотидом, необходимые для детекции целевой ДНК.На Рис. 23 показаны результаты выполненных контрольных экспериментов. Для NHCконтроля регистрируется наименьший биолюминесцентный сигнал, который обусловлен лишьнеспецифическимсвязываниемгибридногобелкаLuc-SAсповерхностьюинекомплементарным зондом. Для SC- и PHC-контролей биолюминесцентный сигнал заметнопревышает фоновый сигнал NHC-контроля. Следовательно, с использованием даннойгибридизационной системы можно достоверно определять специфические взаимодействиямежду иммобилизованным зондом и комплементарным к нему олигонуклеотидом.5000000I, RLU40000003000000200000010000000PHCSCNHCРис.
23. Биолюминесцентный сигнал для контролей. Условия: 1 мкл 10 мкМ растворазонда в буфере SpB иммобилизовали на поверхности лунок полистирольного планшета, 100мкл 16 нМ раствора Luc-SA использовали для инкубации в течение 60 мин при 37 °С.Выбор метода иммобилизации олигонуклеотидных зондов.Мы сравнили триметода иммобилизации олигонуклеотидного зонда на поверхности лунок полистирольногопланшета:1) сорбция зонда на полистирольную поверхность планшета;2) сорбция зонда на полистирольную поверхность, предварительно обработаннуюполилизином[199],когдасвязываниезондасповерхностьюпроисходитзасчетэлектростатических взаимодействий положительно заряженных аминогрупп полилизина сотрицательно заряженными фосфатными группами ДНК-зонда;3) сорбция зонда на полистирольную поверхность, обработанную полилизином споследующей обработкой поверхности глутаровым альдегидом (ГА), который образуетиминнуюсвязьсаминогруппойлизинаиконцевойаминогруппойДНК-зонда,ивосстановлением до амина путем добавления NaBH4.87Биотинилированный SC-зонд (см.
выше) иммобилизовали тремя описанными вышеспособами, затем инкубировали с раствором гибридного белка Luc-SA и измерялибиолюминесцентный сигнал. Для определения фонового сигнала параллельно проводилианалогичные эксперименты с использованием планшетов, обработанных так же, как и передиммобилизацией зондов, но без последующей иммобилизации зондов.Б.300006025000502000040150000,81000045000200I фона, %I, RLU.A.30201000,8420Рис. 24.
А. Зависимость биолюминесцентного и фонового сигнала от способаиммобилизации биотинилированного SC-зонда при различных концентрациях Luc-SA 0,8; 4; 20нМ. Фоновый сигнал, получен при той же обработке планшета, но без добавления SC- зонда.Условия гибридизации: 1 мкл 5 мкМ раствора SC-зонда; условия инкубации с Luc-SA: 100 мклраствора Luc-SA, инкубация 60 мин при 37 °С. Б. Вклад (%) фонового сигнала в общий сигналбиолюминесценции для данных, показанный на Рис. 24 А.Согласно полученным данным (Рис. 24), предварительная обработка поверхностиполилизином и последующая обработка глутаровым альдегидом не увеличивают, а, наоборот,уменьшают наблюдаемый биолюминесцентный сигнал по сравнению с биолюминесцентнымсигналом,регистрируемымприсорбции зонда на необработанную полистирольнуюповерхность. Кроме того, неспецифическая сорбция Luc-SA на поверхности, обработаннойполилизином, в 150 раз превышает величину неспецифической сорбции Luc-SA на поверхностинеобработанного полистирольного планшета.
Таким образом, дальнейшие эксперименты мыпроводили при иммобилизации зонда непосредственно на поверхность полистирольногопланшета.Оптимизация условий детекции амплифицированнойДНК. В неконкурентныхметодах анализа чувствительность определяется чувствительностью регистрации сигнала изначением фонового сигнала. Следовательно, при использовании биолюминесцентного методадетекции, который отличается высокой чувствительностью регистрации метки, снижениефонового сигнала является основной задачей. Для выявления условий анализа, при которыхсоотношение сигнал/фон будет максимальным, мы провели оптимизацию используемой88системыпоследующимпараметрам:концентрацияДНК-зонда,объемДНК-зонда,концентрация Luc-SA, время и температура инкубации с Luc-SA. Для определениянасыщающей концентрации ДНК-зонда и оптимальной концентрации Luc-SA были полученызависимости биолюминесцентного сигнала от концентрации иммобилизуемого зонда принескольких концентрациях гибридного белка Luc-SA.
1 мкл раствора зонда в буфере SPBиммобилизовали на полистирольном планшете, добавляли в каждую лунку по 40 нгамплифицированной ДНК в буфере SSPE. После гибридизации вводили по 100 мкл раствораLuc-SA в буфере PBST-BSA, инкубировали в течение 60 мин при 37 °С и перемешивании (180об/мин) и измеряли биолюминесцентный сигнал. Параллельно те же эксперименты выполнялив отсутствие амплифицированной ДНК, чтобы измерить величину фонового сигнала.АБ11000000I, RLU367100000412345678601234401I, %252320100004805101520концентрация зонда, мкМ005101520концентрация зонда, мкМРис. 25.
Зависимость биолюминесцентного сигнала (А) и неспецифического сигнала в %(Б) от концентрации иммобилизованного олигонуклеотидного зонда в присутствии (кривые 1-4)и в отсутствие определяемой ДНК (кривые 5-8) при различных концентрациях Luc-SA.Обозначения: [Luc-SA], нМ = 10 (кривые 1 и 5), 3,3 (кривые 2 и 6), 1 (кривые 3 и 7), 0,2 (кривые4 и 8).Результаты (Рис. 25А) показывают, что зависимость биолюминесцентного сигнала отконцентрации зонда при изменении концентрации Luc-SA от 0,2 до 10 нМ описывается кривойс насыщением.
При концентрации Luc-SA 10 и 3,3 нМ насыщающая концентрация зондасоставила 10 мкМ, а при концентрации Luc-SA 1 и 0,2 нМ - 2,5 мкМ. Неспецифическая сорбция,рассчитанная как отношение биолюминесцентных сигналов в отсутствие ДНК (фон) и вприсутствии ДНК (Рис. 25Б), была наиболее высокой при 10 нМ Luc-SA и достигала 50 % приуменьшении концентрации зонда до 2,5 мкМ. При других концентрациях Luc-SA (от 0,2 до 3,3нМ) значения фонового сигнала не превышали 20- 30 %.
Таким образом, из полученных данныхследует, что концентрация Luc-SA должна быть не более 3,3 нМ. Для дальнейшихэкспериментов использовали следующие условия: количество зонда 10 пикомоль на лунку, аконцентрация Luc-SA составляла 3,3 или 1 нМ.89Далее мы изучили влияние объема иммобилизуемого зонда (от 1 до 40 мкл) наспецифическийи неспецифический сигналы при постоянном количестве зонда в лунке.Согласно полученным данным (Рис. 26, кривая 1), биолюминесцентный сигнал возрастаетпропорционально увеличению объема иммобилизованного олигонуклеотида до 30 мкл припостоянном его количестве в лунке, что можно объяснить увеличением доступности центровсвязывания зондов с молекулами комплементарной ДНК и Luc-SA.
При объеме зонда 30 мклзонд занимает максимальную площадь (полностью покрывает дно микрокюветы). При этомфоновыйсигнал,полученныйвотсутствиеопределяемойДНК,определяетсянеспецифическими взаимодействиям гибридного белка Luc-SA с поверхностью лунокполистирольного планшета, остается на постоянном уровне и не зависит от объема зонда.Чтобы минимизировать свободную поверхность, на которую возможна неспецифическаясорбция гибридного белка Luc-SA, мы использовали обработку поверхности планшетанекомплементарным олигонуклеотидом NHC. Условия эксперимента были те же, что и впредыдущем пункте, при этом растворы для гибридизации содержали дополнительно 10 мкМNHC.Согласно полученным данным (Рис.
26) добавление NHC (кривая 4) не влияет нанеспецифический биолюминесцентный сигнал, но заметно снижает специфический сигнал, чтоможно объяснить ухудшением доступности специфических зондов (кривая 3), поэтому данныйолигонуклеотид как агент блокирующий свободную поверхность в дальнейших экспериментахне использовали. Таким образом, для дальнейших экспериментов объем олигонуклеотидногозонда составлял 30 мкл в буфере SpB.123430I.10-5, RLU2520151050010203040объем зонда, мклРис. 26. Зависимость биолюминесцентного сигнала от объема наносимого зонда прииммобилизации в отсутствие (кривые 1 и 2) и в присутствии некомплементарныхолигонуклеотидов (кривые 3 и 4). Условия: 20 нг/лунка определяемой ДНК в буфере SSPE(кривые 1 и 3) и без ДНК (кривые 2 и 4). Другие условия те же, что и на Рис.
25, концентрацияLuc-SA 3,3 нМ.90Далее было изучено влияние объема раствора Luc-SA на величину неспецифическойсорбции. В предыдущих экспериментах объем Luc-SA составлял 100 мкл. Поскольку зондиммобилизовали на дне лунки, то уменьшение объема Luc-SA могло способствовать снижениюнеспецифической сорбции на стенках лунки. При уменьшении объема раствора Luc-SA от 100до 50 мкл биолюминесцентный сигнал уменьшился в 1,5 раза, и неспецифическая сорбция приэтом тоже уменьшилась. Однако соотношение сигнал/фон практически не изменилось. Поэтомув дальнейших экспериментах использовали 100 мкл раствора Luc-SA.Было изучено влияние температуры и длительности инкубации образца с раствором LucSA на время установления равновесия и соотношение сигнал/фон. Как показано на Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
