Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение (1105561), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Микробныеклетки осаждали центрифугированием в течение 1 минуты при 10000 g. Супернатант удаляли,добавляли 100 мкл ТЕ-буфера и ресуспендировали осадок с помощью шейкера. Суспензиюклеток инкубировали в термостате 20 минут при 99ОС. После термостатирования образцыцентрифугировали в течение 1 минуты при 10000 g. Супернатант переносили в новые пробиркии использовали для ПЦР (по 1 мкл на одну реакцию)Для амплификации консервативного фрагмента гена gadB клеток E. coliиспользовали следующие праймеры:прямой- CACGTTTTGGTGCG AAGTCTобратный- GACGACGAAAATGTCCACAA.ПЦР проводили в общем объеме 25 мкл в 0,2 мл тонкостенных пробирках. Реакционная смесь,содержала:РеагентКоличествоВода дистиллированная10,7 мклПЦР-буфер: 10×кратный буфер Taq с (NH4)2SO42,5 мклРаствор хлорида магния (25 мМ)1,0 мклРабочий раствор dATP (2,5 мМ)1,0 мклРабочий раствор dGTP (2,5 мМ)1,0 мклРабочий раствор dCTP (2,5 мМ)1,0 мклРабочий раствор dTTP (1 мМ)1,5 мклРабочий раствор dUTP-биотин (1 мМ)1,0 мклРабочий раствор прямого праймера (20 пкмоль/мкл)1,0 мклРабочий раствор обратного праймера (20 пкмоль/мкл)1,0 мклРаствор Taq ДНК-полимеразы (активность 5 е.а./мкл)0,3 мклОбразцы ДНК клеток E.
coli1,0 мклВ пробирку, помеченную как отрицательный контроль, вместо образца ДНК вносили 1 мклдистиллированной воды. Проводили 30 циклов ПЦР, температура отжига составляла 55 ˚С,время отжига – 30с.Концентрацию амплифицированной ДНК определяли спектрофотометрически послеудаления низкомолекулярных компонентов ПЦР-смеси с использованием био-спин колонки G25, уравновешенной буферным раствором TE (объем пробы составлял 120 мкл).
КоэффициентэкстинкцииимолекулярныйвесДНКрассчитывалисиспользованиемhttps://eu.idtdna.com/calc/analyzer. Для определяемой ДНК ε260= 1096400 M-1см-1, MW= 35 кДа.63Иммобилизация олигонуклеотидных зондов на полистирольный планшет. В работеиспользовали стрипованные полистирольные планшеты высокой сорбционной емкости.Иммобилизацию зондов проводили из буферного раствора 1×SpB.
Объем раствора,содержащего иммобилизуемый зонд, составлял от 1 до 30 мкл. Нанесенные олигонуклеотидывысушивали в течение 30-60 минут при 60 °С в зависимости от объема раствора, содержащегозонд. Затем в лунки планшета вносили по 200 мкл раствора PBS, содержащего 1% BSA, 1%казеин и инкубировали в течение ночи при 4 °С. Для контроля неспецифической сорбциииспользовали планшет не обработанный блокирующим раствором.Иммобилизация олигонуклеотидных зондов на полистирольный планшет сиспользованием полилизина.
В лунки полистирольного планшета вносили по 100 мкл раствораполилизина с концентрацией 100 мкг/мл в PBS. Инкубировали 1 час при 37°С и перемешиваниисо скоростью 700 об/мин. Дважды промывали буфером PBS (200 мкл) по 10 мин. Затемдобавляли в лунки по 100 мкл 1%-го раствора глутарового альдегида в буфере NCA.Инкубировали 1 час при 37 °С, 700 об/мин, промывали по 10 мин PBS (200 мкл), затем 10 минраствором PBS, разбавленным в 10 раз и высушивали в термостате при 60 °С. Затем вподготовленные лунки вносили по 1 мкл раствора олигонуклеотидного зонда в буферномрастворе 1×SpB с содержанием 0,32 М Na2SO4, 0,25 М Na2HPO4 и инкубировали в течение 30минут при 60 °С. Свободные альдегидные группы и иминные связи восстанавливали растворомNaBH4.
Для этого в лунки вносили по 100 мкл раствора NaBH4 с концентрацией 7 мг/мл вбуфере PBS и инкубировали в течение 15 мин при 37°С, 700 об/мин. Остатки раствора NaBH4удаляли и лунки промывали 3 раза по 200 мкл PBS. Затем в лунки планшета вносили по 200 мклраствора PBS, содержащего 1% BSA, 1% казеин и инкубировали в течение ночи при 4 °С.Модификация полистирольной поверхности плюроником. В лунки планшета вносилипо 200 мкл водного раствора плюроника с концентрацией 10 мг/мл и инкубировали в течениеночи при комнатной температуре. После инкубации планшет промывали 3 раза по 200 мкл H2O.Планшет высушивали при 60°С в течение 10 минут. Далее на модифицированную поверхностьиммобилизовали зонды по методике, описанной для полистирольного планшета.Гибридизация амплифицированной ДНК с иммобилизованным зондом. РастворопределяемойДНК в буфере 2 x SSPE объемом 70 мкл вносили в лунки планшета симмобилизованными зондами и инкубировали при 45 °С в течение часа при перемешивании1000 об/мин.
Несвязавшуюся ДНК удаляли промыванием буфером PBST два раза по 15 минут,1раз при температуре гибридизации, 2-й раз - при 37 °С.Образование комплекса Luc-SA c иммобилизованной биотинилированной ДНК иизмерение интенсивности биолюминесценции. В лунки планшета c иммобилизованной ДНК64вносили 100 мкл Luc-SA в буфере PBST-BSA, инкубировали при 37, 23 либо 4°С, приперемешивании со скоростью 120 об/мин. Затем раствор удаляли из лунок и 4 раза промывалибуферным раствором PBST по 200 мкл на лунку. Для определения интенсивностибиолюминесценции планшет разделяли на отдельные ячейки. В каждую вносили по 100 мклсубстратной смеси ATP-LH2 и регистрировали биолюминесцентный сигнал.3.4.7. Иммуноанализ прогестерона на основе биолюминесцентного резонансногопереноса энергии (BRET) с использованием люциферазы светляков LuciolamingrelicaРегистрацию спектров флуоресценции красителя проводили на люминесцентномспектрометре LS 50B в режиме «флуоресценция» при ширине щели 10 нм. Вофлуориметрическую кювету помещали 200 мкл раствора красителя Alexa-fluor в PBS вконцентрации 100 мМ и регистрировали спектры флуоресценции в интервале от 600 до 700 нмпри λex = 612 нм.
Анализ спектров красителей проводили с использованием данных,полученных с использованием Fluorescence SpectraViewer http://www.lifetechnologies.com/ru/ru/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html.Получение конъюгатов люцифераза-прогестерон (Luc-Pg)Стабильность люциферазы в присутствии ДМФА. К 5 мкл RLuc, с концентрацией 3мг/мл добавляли 7,5; 5; 3; 1,5; 0 мкл ДМФА и буферный раствор PBS до 15 мкл, инкубировали втечение 120 минут при +4 °С и умеренном перемешивании. Полученные после инкубациирастворы разбавляли в 300 раз, отбирали аликвоты объемом 50 мкл, добавляли 50 мклсубстратной смеси ATP-LH2 и измеряли интенсивность биолюминесценции на люминометреFB 12 Femtomaster с использованием нейтрального светофильтра с пропусканием 0,14 %.Кинетика инактивации люциферазы в присутствии ДМФА.
Готовили растворы,содержащие 1 мг/мл люциферазы в буфере PBS и 10, 5, 0 % по объему ДМФА. Полученныерастворы инкубировали при 4 °С и умеренном перемешивании, через 0, 10, 20, 40, 120 минутинкубации отбирали аликвоты объемом 5 мкл и разбавляли в 200 раз буферным раствором PBS.К 50 мкл полученных растворов добавляли 50 мкл субстратной смеси ATP-LH2 и измерялиинтенсивность биолюминесценции как описано выше.Активацияпрогестерона.В100мклДМФАрастворяли3,1мг3-о-карбоксиметилоксим прогестерона (Pg), добавляли 0,95 мг дициклогексилкарбодиимида (ДЦК)и 1,7 мг N-гидроксисукцинимидного эфира (NHS).
Полученную смесь инкубировали прикомнатной температуре в течение 4-х часов при умеренном перемешивании (100 об/мин) идалее в течение ночи при 4 °C без перемешивания. О степени прохождения реакции судили пообразованию осадка мочевины. Образовавшуюся мочевину отделяли центрифугированием в65течение 5 минут при 12000 g. Супернатант, содержащий активированное карбокси-производноепрогестерона, разбавляли ДМФА в необходимое количество раз и использовали в реакцииконъюгации с люциферазой.Конъюгация прогестерона с люциферазой. К 100 мкл Luc с концентрацией 1 мг/мл вбуферном растворе добавляли 10 мкл раствора активированного производного прогестеронаразличной концентрации в ДМФА. Молярные соотношения Luc:Pg в реакционной смесисоставляли: 1:60, 1:40, 1:20, 1:10, 1:5. Для инкубации использовали буферные растворыследующего состава: 1) 0,01 М боратный буфер, pH=8,6; 2) буфер PBS, pH=7.8; 3) буфер PBSS:PBS +10 мМ MgSO4+ 2 мМ ATP, pH=7.8.
Реакцию проводили в течение двух часов во льду приумеренном перемешивании (100 об/мин). Полученный продукт центрифугировали в течение 5мин при 12000 g. Избыток прогестерона и компоненты буферного раствора отделяли на спинколонке G-25, уравновешенной буфером GF2, используемым для хранения люциферазысогласно инструкции производителя. Полученные конъюгаты хранили при 0°С.Измерение биолюминесцентной активности конъюгатов. Раствор конъюгатаобъемом 5 мкл разбавляли в 200 раз буфером PBS, отбирали 5 мкл полученного раствораконъюгата, добавляли 50 мкл субстратной смеси ATP-LH2, разбавленной в два раза буферомPBS и регистрировали биолюминесцентный сигнал на люминометре FB 12 Femtomaster сиспользованием нейтрального светофильтра с пропусканием 1,25 %.Изучениеспособностипрогестеронаспецифический комплекс с антителами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
