Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение (1105561)
Текст из файла
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА»ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописиСМИРНОВА ДАРЬЯ ВАСИЛЬЕВНАГИБРИДНЫЕ БЕЛКИ И КОНЪЮГАТЫ НА ОСНОВЕ ЛЮЦИФЕРАЗЫСВЕТЛЯКОВ LUCIOLA MINGRELICA И ИХ БИОАНАЛИТИЧЕСКОЕПРИМЕНЕНИЕСпециальности:03.01.04 – биохимия03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнология)Диссертацияна соискание ученой степеникандидата химических наукНаучный руководитель:доктор химических наук,профессор Н.Н.
УгароваМосква – 2015ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................................................ 51.ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................... 72.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................................... 112.1. Люциферин-люциферазная система светляков и ее биоаналитических применение .. 112.1.1. Применение люциферазы в методах анализа, основанных на детекции ее субстратов(АТP и люциферин) .................................................................................................................
142.1.2. Применение люциферазы в методах анализа, основанных на ее детекции как маркера.................................................................................................................................................. 152.2. Методы получения бифункциональных молекул на основе люциферазы ифотопротеинов ............................................................................................................................... 182.2.1.
Методы химической конъюгации. Основные подходы ................................................ 192.2.2. Химически полученные конъюгаты на основе люцифераз и фотопротеинов ............. 212.2.3. Методы генетической инженерии по созданию гибридных белков на основелюциферазы ............................................................................................................................. 252.2.4. Гибридные белки, полученные на основе люцифераз светляков................................. 262.3. Применение конъюгатов и гибридных белков на основе люциферазы светляков вбиоспецифическом анализе ..........................................................................................................
322.3.1. Применение конъюгатов и гибридных белков на основе люциферазы светляков вгетерогенном ИФА .................................................................................................................. 332.3.2. Применение гибридных белков на основе люциферазы светляков для определенияДНК или РНК ........................................................................................................................... 362.4. Биоаналитические системы на основе биолюминесцентного резонансного переносаэнергии (BRET) с использованием люциферазы. .....................................................................
392.4.1. Основные принципы BRET ........................................................................................... 392.4.2. BRET-системы на основе Renilla люциферазы ............................................................. 412.4.3. BRET-системы на основе люциферазы светляков ........................................................ 422.4.4. Аналитическое применение BRET на основе люциферазы ......................................... 463.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ....................................................................................
503.1. Вещества и реагенты .............................................................................................................. 5023.2. Штаммы и плазмиды ............................................................................................................. 533.3. Аппаратура ..............................................................................................................................
533.4. Методики проведения экспериментов ................................................................................. 543.4.1.Методы работы с ДНК ............................................................................................... 543.4.2.Конструирование плазмид ......................................................................................... 553.4.3.Получение гибридных белков Luc-bccp, Luc-SA и термостабильной люциферазы L.mingrelica, содержащих His6-последовательность .................................................................
573.4.4.Изучение свойств гибридных белков Luc-bccp, Luc-SA........................................... 583.4.5.Применение гибридных белков Luc-bccp и Luc-SA в иммуноферментном анализедля детекции клеток Salmonella .............................................................................................. 603.4.6.Применение гибридного белка Luc-SA для детекции биотинилированной ДНКклеток E. coli ............................................................................................................................ 633.4.7.Иммуноанализ прогестерона на основе биолюминесцентного резонансногопереноса энергии (BRET) с использованием люциферазы светляков Luciola mingrelica ....
653.4.8.Гетерогенный конкурентный иммуноанализ прогестерона с использованиембиолюминесцентного метода детекции .................................................................................. 704.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ...................................................................................... 724.1. Получение и свойства гибридного белка люциферазы с биотинсвязывающим доменом(bccp)................................................................................................................................................
724.1.1. Конструирование плазмиды .......................................................................................... 724.1.2. Свойства гибридного белка люцифераза-bccp .............................................................. 734.2. Получениеисвойствагибридныхбелковлюциферазысострептавидином..........................................................................................................................................................
764.2.1. Конструирование плазмид ............................................................................................. 764.2.2. Получение гибридных белков люцифераза-стрептавидин ........................................... 774.2.3. Свойства гибридных белков люцифераза-стрептавидин ............................................. 784.3.Применение гибридных белков Luc-SA и Luc-bccp в биоспецифическом анализе.......................................................................................................................................................... 814.3.1.
Специфическая детекция клеток Salmonella с использованием гибридных белков Lucbccp и Luc-SA............................................................................................................................ 8234.3.2. Гибридизационный анализ ДНК с использованием гибридного белка Luc-SA................................................................................................................................................... 854.4. Иммуноанализ прогестерона на основе биолюминесцентного резонансного переносаэнергии (BRET) с использованием люциферазы светляков Luciola mingrelica ....................
964.4.1.Конструирование системы для эффективного BRET ............................................... 964.4.2.Получение и свойства конъюгатов люцифераза-прогестерон................................ 1004.4.3.Получение и свойства конъюгатов антитело-краситель......................................... 1064.4.4.Оптимизация условий регистрации BRET-сигнала и анализа прогестерона ........ 1114.4.5.Гетерогенный иммуноанализ прогестерона с использованием биолюминесцентногометода детекции .....................................................................................................................
1225.ВЫВОДЫ ............................................................................................................................... 1276.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................... 1294СПИСОК СОКРАЩЕНИЙГА–глутаровый альдегидДНК–дезоксирибонуклеиновая кислотаДМФА–диметилформамидДТТ–1,4-дитиотреитолДЦК–дициклогексилкарбодиимидИФА–иммуноферментный анализКОЕ–колониеобразующая единицаПААГ–полиакриламидный гельПЦР–полимеразная цепная реакцияРНК–рибонуклеиновая кислотаТрис–трис(гидроксиметил)аминометанТМБ–тетраметилбензидинЭДТА–этилендиаминтетрауксусная кислотаA, A600–поглощение, поглощение при 600 нмAb–антителаAMP–аденозин-5’-монофосфатATP–аденозин-5’-трифосфатb–биотинBSA–бычий сывороточный альбуминbccp–биотин-связывающий доменHis6–гексагистидиновая последовательностьImax–максимальная интенсивность сигнала биолюминесценции илифлуоресценцииI–интенсивность сигнала биолюминесценцииFl–краситель Alexa-fluorFl-Ab–конъюгат антитело-красительkcat–каталитическая константаKm–константа Михаэлиса–константа Михаэлиса по ATPKmATP5KmLH2–константа Михаэлиса по люциферинуLH2–люциферинLuc–люциферазаGLuc–зеленая форма люциферазыRLuc–красная форма люциферазыLuc-Pg–конъюгат люциферазы с прогестерономLuc-SA–гибридный белок люциферазы со стрептавидиномLuc-bccp–гибридный белок люциферазы с биотин-связывающимдоменоммолекулярный весMWNHS–N-гидроксисукцинимидный эфирPDS–пиридил-дисульфидная группаPg–прогестеронPPi–неорганический пирофосфатPS–полистиролPVP–поливинилпирролидонRLU–относительные световые единицы, 1 RLU = 109квант/сSA–стрептавидинSDS–додецилсульфат натрияSPDP–N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионатTS–термостабильный мутант люциферазыλmax; λmax em–длина волны, при которой наблюдается максимум спектрабиолюминесценции (флуоресценции)λex–длина волны, при которой наблюдается максимумвозбуждения красителяATP-LH2–субстратная смесь для измерения люциферазной активности61.
ВВЕДЕНИЕАктуальность работы. В настоящее время актуальной задачей является создание новыхбиоаналитических высокочувствительных и высокоспецифичных реагентов для определениянаноколичеств различных физиологически активных веществ и патогенных микроорганизмов.Одним из способов получения таких реагентов является создание бифункциональных молекуллибо генноинженерными методами, либо методами химической конъюгации. Такие молекулысовмещают в себе высокую чувствительность белка-детектора с высокой селективностьюкомпонента, способного связываться с изучаемой мишенью. Использование люциферазысветляковвкачествечувствительностьюбелка-детекторарегистрацииметкиобладаетрядомвследствиепреимуществ:высокогоквантовоговысокойвыходабиолюминесцентной реакции (окисление люциферина кислородом воздуха в присутствии ATPи Mg2+), низким фоновым сигналом, который определяется стабильностью субстрата иотсутствием люциферазы в анализируемых биологических системах, а также простойпроцедурой наработки и выделения белка в необходимых количествах.
Приоритетнымнаправлением получения бифункциональных молекул на основе люциферазы светляковявляется экспрессия генноинженерных конструкций. Среди гибридных белков на основелюциферазы наибольший интерес представляют биотин- и стрептавидин-люциферазы,позволяющиефиксироватьвысокоаффинныхмолекулулюциферазыбиотин-стрептавидиновыхнаповерхностивзаимодействий.Вмишенилитературепутемописаныбиотинилированные гибридные белки на основе люцифераз светляков P.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
