Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение (1105561), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Плазмида His6-SA-Luc является оптимальной дляэкспрессии гибридного белка люцифераза-стрептавидин (Luc-SA), который образуетсяпреимущественно в высокоактивной тетрамерной форме с высоким сродством к биотину, несодержит примесей активной свободной люциферазы и, следовательно, может бытьиспользован в разработке аналитических систем, основанных на биолюминесцентной детекции.4.3.Применение гибридных белков Luc-SA и Luc-bccp вбиоспецифическом анализеВ биоаналитических системах на основе неконкурентной схемы иммуноанализачувствительность определяется значением фонового сигнала и минимальной детектируемойконцентрацией метки, которая определяет величину отклика системы на изменениеконцентрации аналита. Для определения люциферазной активности была разработанаспециальная субстратная смесь ATP-LH2, включающая в себя 0,025 М КН2РО4, 0,025 M81К2НРО4, 2 мМ ЭДТА, 7,5 мМ MgSO4, 1 мМ АТР, 0,15 мМ LH2, 1 % Неонол-10, 50 мкМ Na4P2O7,рН 7,8, которая позволяла наблюдать стабильный во времени биолюминесцентный сигнал,величина которого была пропорциональна концентрации фермента в интервале 10 -13-10-9 M.Для определения предела обнаружения люциферазы в составе гибридных белков, былипостроены градуировочные зависимости биолюминесцентного сигнала от концентрациигибридных белков (Рис.
19).7,06,0logI, RLU5,04,0lucLuc3,0Luc-SAluc-str2,0Luc-bccpluc-bccp1,00,0-14-13-12-11logC, М-10-9Рис. 19. Зависимость биолюминесцентного сигнала от концентрации гибридного белка вреакционной смеси. Условия: буфер PBS, регистрация биолюминесцентного сигнала наприборе ЛЮМ-1.БелокУравнениеПредел обнаружения, МLucLogI=(15,3±0,2)+ (1,00 ±0,02)·LogC5·10-14Luc-SALogI=(15,1±0,1)+ (1,00 ±0,01)·LogC10·10-14Luc-bccpLogI=(13.8±0,1)+ (0,91 ±0,01)·LogC10·10-14Зависимости биолюминесцентного сигнала от концентрации гибридных белков,полученные для Luc-bccp и Luc–SA, иллюстрируют высокую чувствительность анализа прииспользовании люциферазы в качестве метки.
Предел обнаружения в данном случае составляет50-100 фМ белка.4.3.1.Специфическая детекция клеток Salmonella сиспользованием гибридных белков Luc-bccp и Luc-SAПолученные гибридные белки Luc-bccp и Luc-SA могут быть использованы в различныхвариантах биоспецифического анализа на основе биотин-стрептавидиновых взаимодействий:для детекции различных биотинилированных мишеней (белков, олигонуклеотидов, ДНК), а82также детекциинековалентных комплексовмикроорганизмовс биотинилированнымиантителами. В данной работе мы показали возможность применения гибридных белков длядетекции инактивированных клеток Salmonella с использованием схемы двухстадийногосэндвич-анализа, представленной на Рис.
20 с использованием физической сорбцииулавливающих антител на поверхность полистирольного планшета.иммунокомплексыРис. 20. Схема детекции клеток Salmonella с использованием биотинилированных инебиотинилированных антител и комплекса люцифераза-стрептавидин.Образующиеся специфические иммунокомплексы антитело-антиген-биотинилированноеантителодетектировалилибосиспользованиемгибридногобелкаLuc-SA,либо,нековалентного комплекса Luc-bccp со стрептавидином (Luc-bccp---SA). Было показано, чтодля получения Luc-bccp---SA оптимальное молярное соотношение реагентов Luc-bccp:SAсоставляет 1:1 [191].Помимо физической адсорбции антител на поверхность полистирольного планшета, дляполучения иммуносорбента мы применили химическую иммобилизацию антител.
В этомслучае вместо полистирольного планшета мы использовали монодисперсные полистирольныечастицы (d=240 нм) покрытые плюроником [80], модифицированным пиридилдисульфиднымигруппами, позволяющими проводить химическую иммобилизацию антител. Преимуществаданного подхода заключались в увеличении рабочей поверхности на 2 порядка, снижениинеспецифических гидрофобных взаимодействий благодаря способности плюроника, тройногоблок-сополимера с двумя концевыми относительно гидрофильными полиоксиэтиленовымиблоками и гидрофобным полиоксипропиленовым блоком, отвечающим за адсорбцию наполистироле, «покрывать» собой гидрофобную поверхность частиц, предотвращая тем самымнеспецифическую сорбцию белков, а также их денатурацию и инактивацию, которая имеетместо при прямой адсорбции белков на гидрофобной поверхности частиц [192-194].
Крометого, при химической иммобилизации на плюронике антитела оказываются соединенными с83полистирольной частицей через спейсер, позволяющий им сохранять подвижность впространстве, что увеличивает доступность антител для аналита.Схема химической иммобилизации антител на поверхности полистирольных частицпредставлена ниже.A. Схема активации антител с использованием реагента ТраутаБ. Схема химической иммобилизация активированных антител на полистирольные частицы,модифицированные плюроником, содержащим пиридилдисульфидные группыОбозначения: Ab- антитело, PS- полистирольные частицы, F108-PDS- плюроник содержащийпиридилдисульфидные группы.Результаты детекции клеток Salmonella с использованием комплекса Luc-bccp---SA игибридного белка Luc-SA на планшете, а также гибридного белка Luc-SA на частицахпредставлены на Рис.
21. Согласно полученным результатам, при проведении анализа напланшете с использованием Luc-bccp---SA и Luc-SA минимально определяемая концентрацияклеток составила 5·104 и 104 KOE/мл соответственно, при проведении анализа на частицах сиспользованием Luc-SA - 105 KOE/мл. При проведении анализа на планшете использованиекомплекса Luc-bccp---SA лишь незначительно увеличило чувствительность анализа посравнению с Luc-SA, поэтому применение Luc-SA является приоритетным, так как не требуетдополнительного использования SA. Использование полистирольных частиц с химическииммобилизованными антителами при концентрации клеток более 105 KOE/мл способствовалозначительному увеличению чувствительности (в 9 раз), что обусловлено описанными вышепреимуществами химической иммобилизации антител на частицы.84106Luc-bccp, планшетLuc-SA, планшет50Luc-SA, частицы840I/I0, отн.ед.46I/I0, отн.ед.I/I0, отн.ед.5342302010210 345670 3lg [клетки], КОЕ/мл45670 3I/I0, отн.ед.4567lg [клетки], КОЕ/млlg [клетки], КОЕ/млРис.
21. Зависимость отношения I/I0 от концентрации клеток Salmonella сиспользованием гибридных белков Luc-SA и Luc-bccp при различных способах иммобилизацииулавливающих антител: физическая сорбция на полистирольный планшет («планшет») ихимическая иммобилизация антител на поверхность полистирольных частиц («частицы»)На примере разработанного метода показано успешное применение гибридов Luc-bccp иLuc-SA в иммуноанализе микроорганизмов с использованием биотинилированных антител.Чувствительность метода сопоставима с чувствительностью как традиционных иммунометодовс использованием пероксидазы в качестве метки [173, 195, 196], так и методов на основелюцифераз светляков, в которых предел обнаружения варьируется от 7,3·104 КОЕ/мл до 2,3·107КОЕ/мл в зависимости от состава селективной среды и природы улавливающего агента [143,197].
Полученные результаты демонстрируют перспективность использования гибридныхбелков Luc-bccp и Luc-SA в качестве универсальных реагентов для разработки новыхвысокочувствительных систем иммуноферметного анализа микроорганизмов с использованиемсоответствующих биотинилированных антител.4.3.2.Гибридизационный анализ ДНК с использованиемгибридного белка Luc-SAГибридный белок Luc-SA был применен для специфической детекции клеток E. coli сиспользованием метода амплификации фрагмента гена gadB (174 bp), кодирующего в клеткахE. coli глутаматдекарбоксилазу [198]. Для внедрения биотина в состав амплифицируемыхучастков ДНК использовали dUTP-11-биотин.
Схема анализа представлена ниже (Рис. 22). ДНКклеток E.coli выделялиамплифицировалиметодомспецифическийтемпературногоучастокДНКлизиса клеток вметодомПЦРсТЕ-буфере,ииспользованиемспецифических праймеров. На поверхности лунок стрипованного полистирольного планшетаиммобилизовали олигонуклеотидные зонды, комплементарные участкам определяемой ДНК.Свободные центры связывания белков блокировали раствором, содержащим 1% BSA, 1%казеин.ЗатемпроводилигибридизациюамплифицированногоучасткаДНКсиммобилизованными зондами, после чего удаляли не связавшуюся ДНК.
Далее в лунки85планшета вносили гибридный белок Luc-SA в буфере PBST-BSA, инкубировали, удалялиостатки свободного гибридного белка, добавляли субстратную смесь ATP-LH2 для определенияактивности люциферазы и регистрировали биолюминесцентный сигнал.ДНК, выделеннаяиз образцаАмплификацияфрагмента гена(ПЦР),введение меткибиотин-dUTPГибридизацияопределяемогофрагмента ДНК симмобилизованнымзондомИнкубация сLuc-SAДобавление ATPLH2 и регистрациясигналаРис. 22. Схема анализа ДНК с использованием биолюминесцентного метода детекцииДля подтверждения подлинности результатов, получаемых при гибридизации целевойДНК, были использованы следующие контроли:1)NHC-негативный контроль. Эксперимент выполняли согласно схеме на Рис.
22,но вместо олигонуклеотидных зондов, комплементарных участкам определяемой ДНК, наповерхности лунок полистирольного планшета иммобилизовали олигонуклеотидные зонды,последовательность которых была некомплементарна целевой ДНК. Их связывание с целевойДНКпоказывалоуровеньфоновогосигнала,обусловленногонеспецифическимивзаимодействиями зонд-ДНК.2)в31SC-положительный контроль иммобилизации. Олигонуклеотидные зонды длинойоснование(NH2-ТТТТТТТТТТТТТTCTAGACAGCCACTCATA-биотин),модифи-цированные на 5’-конце аминогруппой, а на 3’-конце – биотином, иммобилизовали наповерхности лунок планшета, инкубировали с раствором гибридного белка Luc-SA и измерялиинтенсивность биолюминесценции. Наблюдаемый сигнал биолюминесценции указывал наспособность гибридного белка Luc-SA образовывать комплекс с биотином и на эффективностьиммобилизации зондов на поверхности планшета.3)PHC-положительныйконтрольгибридизации.Наповерхностилунокиммобилизовали ДНК-зонд, комплементарный к PHC-олигонуклеотидной последовательностисодержащей биотин:86Проводили гибридизацию, инкубировали с раствором гибридного белка Luc-SA и измерялибиолюминесцентный сигнал.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
