Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение (1105561), страница 23
Текст из файла (страница 23)
40, показывают, что способность конъюгатов Luc-Pg связываться сантителами возрастает с увеличением отношения Luc:Pg от 1:5 до 1:20. Конъюгаты GLuc-Pg иRLuc-Pg с одинаковым отношением Luc:Pg обладают идентичной способностью связыватьантитела.10373,0A450, опт. ед.2,52,01,56542, 31,010,50,00,000,1110[Ab], мкг/млРис. 40. Зависимость оптической плотности от концентрации первичных антител кпрогестерону для конъюгатов с различным соотношением Luc:Pg в реакционной смеси.Обозначения: 1 - исходная люцифераза GLuc; 3, 5, 7 - конъюгаты на основе GLuc с молярнымотношением Luc:Pg 1:5, 1:10, 1:20 соответственно; 2, 4, 6 - конъюгаты на основе RLuc смолярным отношением Luc:Pg 1:5, 1:10, 1:20 соответственно.При отношении Luc:Pg 1:40 и 1:60 наблюдаются кривые идентичные кривым 7, 6 (Рис.40) что свидетельствует о том, что уже при отношении 1:20 все доступные для реакцииконъюгации аминогруппы люциферазы связаны с прогестероном.Для определения количества молекул Pg, связанных с молекулой Luc, были измереныспектры поглощения прогестерона, люциферазы и конъюгатов в интервале длин волн 240-300нм.
При анализе спектров поглощения конъюгатов использовали разложение спектраконъюгата на нормированные спектры поглощения прогестерона и люциферазы, умноженныена соответствующие коэффициенты (см. главу методы). Пример разложения спектрапоглощения конъюгата Luc-Pg, полученного при соотношении Luc:Pg 1:20, представлен на Рис.41.Анализ спектров поглощения конъюгатов подтвердил, что GLuc-Pg, полученные присоотношении Luc:Pg = 1:20, 1:40 и 1:60, имеют одинаковый состав и содержат по 3 молекулыпрогестерона на одной молекуле люциферазы.
Таким образом, конъюгат, полученный присоотношении Luc:Pg = 1:20, содержал максимальное количество прогестерона, приходящеесяна одну молекулу люциферазы (3:1), обладал максимальной способностью связывать антителаи высокой биолюминесцентной активностью (около 70% от активности исходной люциферазы)и был использован в дальнейшей работе.1041A, опт.
ед.0,8Pg0,6Luc0,40,2спектр Luc-Pg1:200240260280300λ, нмРис. 41. Разложение спектра поглощения конъюгата Luc-Pg, полученного присоотношении Luc:Pg 1:20. Обозначения: Pg - нормированный спектр прогестерона,умноженный на рассчитанный коэффициент x, Luc - нормированный спектр люциферазы,умноженный на рассчитанный коэффициент y, спектр Luc-Pg 1:20 – реальный спектрконъюгата.Далее для выбранного конъюгата GLuc-Pg была исследована стабильность люциферазыв его составе и влияние температуры на биолюминесцентный сигнал во время инкубации и егоизмерения.10080I/I06040200050100время, минРис.
42. Зависимость интенсивности биолюминесценции GLuc-Pg в % от длительностиинкубации при 37°С. Условия: 2 нМ GLuc-Pg, буферный раствор PBST-BSA.Как показано на Рис. 42, после инкубации при 37 °С в течение двух часов Luc-Pgсохраняет около 80% активности, а за 30 минут инкубации уменьшение активности непревышает 5%, при этом изменение активности не влияет на форму спектра.Как известно из литературных данных [180], люцифераза светляков (Rluc) обладаетмаксимальной активностью при 37 °С, поэтому мы изучили влияние температуры набиолюминесцентную активность конъюгата GLuc-Pg.
Для этого мы измерили интенсивностьбиолюминесценции при двух длинах волн, используемых для расчета BRET-сигнала (Рис. 13)10550000I, отн. ед.40000300005502000063010000037234температура, °CРис. 43. Зависимость биолюминесцентного сигнала GLuc-Pg от температуры при 550 нми 630 нм. Условия: 2 нМ GLuc-Pg, буферный раствор PBST-BSA, время инкубации 10 мин.Из Рис.
43 следует, что при 37 °С для конъюгата GLuc-Pg, так же как и для люциферазыRLuc наблюдается наиболее высокая биолюминесцентная активность. При 23 °С интенсивностьбиолюминесценции сохраняется на 95-99% в зависимости от длины волны измерениябиолюминесценции, а при переходе к 4 °С снижается на 15-25%.Таким образом, был разработан эффективный метод получения конъюгатов люциферазыс прогестероном, которые обладали высокой биолюминесцентной активностью, стабильностьюи способностью связывать антитела к прогестерону.4.4.3.Получение и свойства конъюгатов антитело-красительВ работе использовали поликлональные антитела кролика к прогестерону. Конъюгатыантител с красителем получали по реакции взаимодействия аминогрупп антител ссукцинимидным производным красителя Alexa Fluor 610-х (Fl).Конъюгаты получали при различных молярных соотношениях антитело: краситель от 1:5до 1:30.
После удаления непрореагировавшего красителя измеряли оптическую плотность прихарактеристической для красителя длине волны А610. На основании этих измерений мырассчитали количество молекул красителя, связанных с 1 молекулой антитела ([Fl]/[Ab]),используя коэффициент экстинкции красителя равный 138000 М-1см-1 (Таблица 17).Таблица 17.
Зависимость количества молекул красителя (Fl), конъюгированных содной молекулой антител (Ab), от состава реакционной смеси.А610Молярное соотношение Fl: Ab в реакционной смеси5102025301,19 ± 0,02 2,37 ± 0,02 4,77 ± 0,03 5,77 ± 0,05 6,00 ± 0,05[Fl], мМ43,0 ± 1,086,0 ± 0,9173 ± 1209 ± 2217 ± 2[Ab], мМ17,417,417,417,417,4[Fl] /[Ab]2,5 ± 0,054,9 ± 0,19,9±0,112,0 ± 0,112,5 ± 0,1106В зависимости от состава реакционной смеси конъюгаты антител с красителем (Fl-Ab)содержали от 2 до 12 молекул красителя на одну молекулу антитела.Полученные конъюгаты были проверены на способность связывать прогестерон сиспользованием метода гетерогенного ИФА. На поверхность планшета иммобилизоваликонъюгат RLuc-Pg, добавляли антитела с различной степенью окрашивания и детектировалиполученный специфический комплекс с использованием антивидовых антител, меченыхпероксидазой.Как показано на Рис. 44, с увеличением количества красителя, приходящегося на однумолекулу антитела, связывание антиген-антитело ухудшается.3,5А450, опт.
ед.302,522,51,5101120,5безантител00,010,1110100[Fl-Ab], нМРис. 44. Способность окрашенных антител связывать прогестерон в зависимости отсостава конъюгата ([Fl] /[Ab]). Кривая «без антител» показывает величину неспецифическойсорбции конъюгата пероксидазы с вторичными антителами на поверхности полистирола.Из представленного графика следует, что лишь при соотношении ~ 2 молекулыкрасителя на одну молекулу антитела, антитела проявляют ту же способность связыватьпрогестерон, что и не окрашенные антитела.
Для конъюгатов Fl-Ab, содержащих 10 молекулкрасителя на одну молекулу антитела, связывающая способность уменьшается почти в два раза.С другой стороны, использование антител с низкой степенью окрашивания может привести книзкому BRET- сигналу.Далее полученные конъюгаты краситель-антитело (Fl-Ab) были проверены наспособность выступать в качестве акцептора в BRET-системе. Для этого смесь, содержащуюRLuc-Pg и Fl-Ab, инкубировали в течение 15 минут в темноте, затем добавляли субстратнуюсмесь ATP-LH2, регистрировали спектр в области 520-700 нм и рассчитывали BRET- сигнал какотношение I630/I590.
В качестве контроля использовали исходную RLuc люциферазу в той же107концентрации. В Таблице 18 приведено отношение I630/I590 (BRET-сигнал) в зависимости отколичества молекул красителя связанного с одной молекулой антитела.Таблица 18. Зависимость I630/I590 для системы RLuc-Pg (или RLuc)---Fl-Ab взависимости от состава конъюгата Fl-AbСреднее содержание красителя на одну молекулу антитела02,55101212,5RLuc-Pg0,51760,69690,82651,32241,34771,3470RLuc0,51840,62560,67610,96450,98730,97311,4I630/I590, отн.
ед.1,31,21,110,9Rluc-Pg0,8Rluc0,70,60,50510Состав конъюгата Fl:AbРис. 45. Зависимость соотношения интенсивностей при 630 и 590 нм от количествакрасителя, связанного с одной молекулой антител для RLuc-Pg и RLuc. Условия инкубации: 30нМ RLuc-Pg или RLuc, 300 нМ Ab или Fl-Ab, инкубация 15 мин при 37°CИз полученных зависимостей (Рис. 45) следует, что при отношении Fl:Ab более 10BRET-сигнал выходит на плато, что можно объяснить максимальным сближением молекулкрасителя и электронно-возбужденного продукта люциферазной реакции - оксилюциферина.Следовательно, конъюгат Fl-Ab состава 10:1, полученный при соотношенииFl:Ab=1:20 вреакционной смеси, является оптимальным для регистрации BRET.Как показано на Рис.
45, наблюдается высокая неспецифической сорбция антител,меченных красителем, на поверхности люциферазы без прогестерона (кривая для RLuc). Дляснижения неспецифической сорбции Fl-Ab мы изучили влияние состава буфера накомплексообразование пары донор-акцептор.Оптимизация состава буфера реакционной смеси для снижения неспецифическогосигнала и стабилизации сигнала биолюминесценции. Из литературы [201] известно, чтоприсутствие поверхностно-активных веществ (ПАВ) снижает неспецифическую сорбциюгидрофобныхмолекул,атакжеможетоказыватьвлияниенаинтенсивностьбиолюминесцентного сигнала [202]. Мы проанализировали влияние различных неионных ПАВ,108таких как Тритон x-100, поливинилпирролидон (PVP), Твин-20 и плюроник в различныхконцентрациях, на величину неспецифического сигнала, и интенсивность биолюминесценции.В этой серии экспериментов мы использовали конъюгат прогестерона с «зеленой» формойлюциферазы (GLuc-Pg) и исходную люциферазу GLuc. Неспецифический сигнал (Iнеспец)рассчитывали как отношение630630⁄ (, )550630630⁄ ( − , − ) −⁄ ( − , )550550⁄ (, − ) −550В скобках указаны компоненты реакционной смеси.Влияние ПАВ на интенсивность биолюминесценции изучали с использованиемрастворов, содержащих GLuc, Ab и соответствующие добавки ПАВ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
