Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение (1105561), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Согласнополученным данным (Рис. 53 А), при повышении температуры соотношение I630/I550увеличивается как для пары донор-акцептор, так и для GLuc. BRET- сигнал специфическоговзаимодействия (BRET*) вычисленный как разность кривых для GLuc-Pg и GLuc, приведен наРис. 53 B. При 23°C наблюдается максимальный BRET* сигнал с минимальнойнеспецифической сорбцией.115А.B.0,290,080,270,0750,07GLuc-Pg0,23BRET*I630/I5500,25GLuc0,210,190,0650,060,0550,050,170,0450,150,04010203040010температура, °С203040Температура, °СРис.
53. А. Зависимость отношения интенсивности биолюминесценции при 630 и 550 нмдля GLuc-Pg и GLuc от температуры в присутствии антител Fl-Ab. В. зависимость BRET*сигнала, рассчитанного как разность кривых для GLuc-Pg и GLuc, от температуры. Условия: 2нМ GLuc-Pg или GLuc, 50 нМ Fl-Ab, буферный раствор PBST-BSA, инкубация 30 мин.
Спектрыснимали при температуре инкубации.Зависимость BRET-сигнала от длительности инкубации пары донор - акцепторопределяется скоростью образования комплекса донор - акцептор. В связи с этим мы изучиливлияние температуры на скорость достижения равновесия в реакции комплексообразованиядонора и акцептора. Для этого были получены зависимости величины BRET-сигнала отдлительности инкубации реакционной смеси, содержащей донор и акцептор.423370,260,25BRET, I630/I5500,240,230,220,210,200,19051015202530время, минРис. 54. Кинетика комплексообразования донор-акцептор при различных температурах:4, 23, 37 °С. Условия: 2 нМ GLuc-Pg, 50 нМ Fl-Ab, буферный раствор PBST-BSA.116Согласно полученным данным (Рис.
54), время достижения равновесия реакциикомплексообразования донор - акцептор составляет от 10 мин для 37 °С до 15 мин для 23 °С и4 °С. При 4 °С наблюдается очень узкий динамический диапазон изменения BRET-сигнала,поэтому проводить анализ при указанной температуре нецелесообразно, хотя в работе [128], гдебыла использована пара донор/акцептор люцифераза Luciola lateralis/краситель Cy3.5,комплексообразование проводили при 0°С.Для выявления влияния температуры и времени инкубации на чувствительность анализасвободного прогестерона и на динамический диапазон изменения сигнала, были полученызависимости BRET-сигнала от концентрации свободного прогестерона в реакционной смесипри 23 и 37 °С при двух временах инкубации 10 минут, когда равновесие еще не установилось,и 20 минут (в равновесных условиях).
За 100% принимали величину BRET-сигнала,полученную в отсутствие свободного прогестерона.100123495BRET, %90858075700,01101001000[Pg], нг/млРис. 55. Зависимости BRET-сигнала от концентрации свободного прогестерона вреакционной смеси при 23 (кривые 2, 4) и 37°С (кривые 1, 3) временах инкубации 10 (кривые 1,2) и 20 минут (кривые 3, 4) Условия: 2 нМ Luc-Pg, 50 нМ Fl-Ab, буферный раствор PBST-BSA.Из данных, приведенных на Рис. 55, следует, что кривые, полученные при 23 °С (кривые2, 4) идентичны в диапазоне концентраций свободного Pg от 1 до 100 нг/мл, при этомнаблюдается большая чувствительность анализа Pg по сравнению с данными, полученнымипри 37 °С.
Кроме того, при 23 °С наблюдается меньшая неспецифическая сорбция (Рис. 53 B).Таким образом, дальнейшие исследования по оптимизации условий проведения гомогенногоиммуноанализа прогестерона на основе BRET проводили при 23 °С (комнатная температура)117Влияниепорядкадобавленияреагентовначувствительностьанализапрогестерона. В основе конкурентного гомогенного иммуноанализа лежит конкуренция двухпроцессов: образование комплекса Luc-Pg---Fl-Ab, в котором осуществляется перенос энергиии комплекса антител со свободным прогестероном Pg---Fl-Ab, в котором переноса энергии ненаблюдается.Согласно полученным кинетическим данным (Рис. 54), равновесие достигается при 20-иминутной инкубации реакционной смеси. Мы изучили влияние порядка смешения реагентов начувствительность анализа до момента установления равновесия.
Для трех серий экспериментовбыли получены зависимости BRET-сигнала от концентрации свободного прогестерона вреакционной смеси при различном порядке смешения реагентов:1) Смешивали растворы GLuc-Pg, Fl-Ab, Pg и инкубировали при 20 минут (кривая 1)2) Смешивали растворы Pg и Fl-Ab, инкубировали в течение 10 мин (кривая 2), 15 мин(кривая 3) или 19 минут (кривая 4), затем добавляли раствор GLuc-Pg и продолжали инкубациюдо 20 минут.3) Смешивали растворы GLuc-Pg, Fl-Ab, инкубировали 10 мин (кривая 5) или 15 мин(кривая 6), затем добавляли раствор Pg и продолжали инкубацию до 20 минут.При добавлении окрашенных антител к смеси Luc-Pg и Pg с последующей инкубацией втечение 20 минут наблюдалось уменьшение BRET-сигнала в 1,3 раза при увеличенииконцентрации Pg от 1 до 1000 нг/мл (Рис.
56 кривая 1). В случае предварительной инкубации Pgс Fl-Ab с последующим добавлением Luc-Pg (Рис. 56 кривые 2,3,4) динамический диапазонуменьшалсясувеличениемдлительностипредварительнойинкубации.Крометого,наблюдалось снижение BRET-сигнала с уменьшением длительности инкубации с Luc-Pg притех концентрациях прогестерона, которые меньше концентрации антител. В этом случае впервоначально образовавшемся комплексе без переноса энергии после добавления Luc-Pgпроисходилозамещениеобразовавшегосясвободногопрогестеронанаконъюгат,иконцентрациякомплекса с переносом энергии была пропорциональна длительностиинкубации с Luc-Pg (1-10 минут).
В присутствии высоких концентраций прогестеронасоизмеримых с концентрацией антител в реакционной смеси (более 100 нг/мл) и недостаткаконъюгата (концентрации конъюгата на два порядка меньшей, чем концентрация Fl-Ab)наблюдалось преимущественное образование комплекса без переноса энергии, которое независело от времени инкубации. Уменьшение времени инкубации с конъюгатом не оказывалосущественного влияния на чувствительность (Рис. 56 кривые 1-4) (однако небольшоеувеличение чувствительности все же наблюдалось).1181234560.260.25BRET, I630/I5500.240.230.220.210.200.190.180.00 0.11101001000[Pg], нг/млРис. 56.
Зависимости BRET-сигнала от концентрации свободного прогестерона вреакционной смеси в присутствии Fl-Ab при различном порядке смешения Luc-Pg и Pg: 1серия 1; 2, 3, 4 –серия 2; 5, 6- серия 3. Условия: 2 нМ Luc-Pg, 50 нМ Fl-Ab, буферный растворPBST-BSA, 23°C.При предварительной инкубации Luc-Pg с Fl-Ab с последующим добавлениемсвободного прогестерона (серия 3), наблюдался высокий BRET сигнал, который слабо зависел(Рис.
56 кривая 5) или почти не зависел (Рис. 56 кривая 6) от концентрации свободногопрогестерона при небольшой продолжительности инкубации с Pg. В данном случаенаблюдалось вытеснение конъюгата из комплекса, в котором наблюдался BRET.НаиболееширокийлинейныйдиапазонизмененияBRET-сигналасвысокойчувствительностью (Рис.
56, B кривая 1) наблюдается при инкубации в течение 20 минутреакционной смеси, содержащей все необходимые реагенты. В этом случае устанавливаетсяравновесие двух конкурирующих процессов: взаимодействия с антителами свободного Pg ипрогестерона в составе GLuc- Pg. В дальнейших экспериментах была использована именно этасхема инкубации: одновременное смешение Luc-Pg и Pg с антителами, меченными красителем,с последующей инкубацией в течение 20 минут при комнатной температуре.Влияние объема вносимой пробы, содержащей прогестерон на чувствительностьанализа.
Еще одним фактором, влияющим на предел обнаружения аналита во вносимой пробе,является ее объем. При увеличении объема вносимой пробы, концентрация определяемоговещества в реакционной смеси разбавляется в меньшее количество раз, при этом пределобнаружения аналита во вносимой пробе может снижаться.119Чтобы выяснить, насколько можно увеличить объем вносимой пробы при сохранениибиолюминесцентного сигнала на высоком уровне, был проведен следующий эксперимент: влунки планшета вносили 20 мкл реакционной смеси, содержащей 6 нМ GLuc-Pg и 150 нМ FlAb, и добавляли 40, 60, 80 и 100 мкл буферного раствора PBST-BSA. Полученную смесьинкубировали, добавляли 50 мкл субстратной смеси ATP-LH2, измеряли интенсивностьбиолюминесценции (Рис.
57 А) и величину BRET-сигнала (Рис. 57 B).При изменении объема добавляемого буферного раствора от 40 до 100 мклбиолюминесцентный сигнал уменьшается всего на 15-20% (Рис. 57 А). При этом, как BRETсигнал (Рис. 57 B, столбцы 2), так и фоновый сигнал (Рис. 57 B, столбцы 1), не зависели отразбавления. Такое небольшое изменение биолюминесцентного сигнала можно объяснить тем,что количество GLuc-Pg и Fl-Ab в лунке при различных добавках буфера не изменялось.Следовательно, можно увеличить объем вносимой пробы свободного прогестерона, тем самымувеличив концентрацию последнего в реакционной смеси.В.1200,31000,25800,260140220I630/I550I, %А.0,1510,120,0500406080100объем буфера, мкл406080100объем буфера, мклРис. 57. Зависимость интенсивности биолюминесценции I (А) и соотношения I630/I550 (B)от объема добавок буферного раствора PBST-BSA в отсутствие (1) и присутствии (2) Fl-Ab.Условия: 20 мкл раствора, содержащего 6 нМ GLuc-Pg в отсутствие Fl-Ab (столбцы 1) или вприсутствии 150 нМ Fl-Ab (столбцы 2) в буферном растворе PBST-BSA, инкубация при 23°C втечение 20 минут.
Где I- относительный биолюминесцентный сигнал, рассчитанный исходя изтого, что биолюминесцентный сигнал при объеме добавки буфера 40 мкл составлял 100%.Для получения градуировочных зависимостей BRET-сигнала (%) от концентрациисвободного прогестерона во вносимой пробе (Рис. 58) при объемах пробы от 40 до 100 мкл, ккоторой добавляли по 10 мкл раствора, содержащего 12 нМ GLuc-Pg и 300 нМ Fl-Ab. Изполученных данных следует, что увеличение объема вносимой пробы прогестерона с 40 до 60мкл не влияет на чувствительность анализа, а при увеличении объема пробы до 80 и 100 мклспособствует увеличению чувствительности анализа.12010040608010095B/B0, %90858075700,01101001000[Pg], нг/млРис.
58. Зависимости BRET-сигнала в % от концентрации свободного прогестерона в водимойпробе при ее различных объемах: 40, 60, 80, 100 мкл соответственно. Условия те же, что наРис. 57.Стоит отметить, что за счет увеличения объема пробы прогестерона с 40 до 100 мклоптимизированные концентрации Luc-Pg и Fl-Ab в реакционной смеси после добавления пробыуменьшились в 2,5 раза, хотя их количество в реакционной смеси осталось неизменным. Такимобразом, были установлены оптимальные условия проведения гомогенного конкурентногоиммуноанализа: 1 нМ Luc-Pg, 25 нМ Fl-Ab в реакционной смеси после добавления пробы,буферный раствор PBST-BSA, инкубация при 23°C в течение 20 минут при одновременномсмешении компонентов реакционной смеси, объем пробы прогестерона 100 мкл, соотношениеобъемов GLuc-Pg: Fl-Ab: Pg= 1:1:10. В оптимизированных условиях был проведен гомогенныйиммуноанализ прогестерона.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
