Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение (1105561), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Как показано на Рис. 46,наименьшее значение неспецифического (фонового) сигнала наблюдалось в присутствии 2%Тритона x-100,0,05% PVP или Твина-20. Однако при использовании PVP наблюдалосьсущественное уменьшение биолюминесцентного сигнала, присутствие же 2% тритона x-100или 0,05% Твина-20 способствовало высокому биолюминесцентному сигналу с минимальнымзначением фона. В дальнейших экспериментах при комплексообразовании использовали буферPBST, содержащий 0,05% Твин-20.0,6100009000800070000,460000,3500040000,2I, RLUI неспец , отн. ед.0,5300020000,1100000неспецифический сигналТритон x-100плюроникPVPТвин-20интенсивностьбиолюминесценцииРис. 46.
Зависимость неспецифического сигнала и интенсивности биолюминесценцииGLuc-Pg от концентрации и структуры ПАВ. Условия: 1,3 нМ GLuc-Pg или GLuc, 130 нМ FlAb, буферный раствор PBS с содержанием 1% BSA с соответствующими добавками ПАВ,инкубация в течение 45 мин при 37°C.109Было проанализировано также влияние BSA на неспецифическое взаимодействиелюциферазы с антителами к прогестерону с использованием гетерогенного ИФА. Наповерхность полистирольного планшета иммобилизовалипрогестерону,полученныйнеспецифическийLuc, добавляли антитела ккомплексLuc-Abдетектировалисиспользованием антивидовых антител, меченых пероксидазой.Как показано на Рис. 47А, добавление 0,1 % BSA не оказывает влияния нанеспецифические взаимодействия при концентрациях антител выше 0,05 мкМ, а при меньшихконцентрациях снижает неспецифическую сорбцию в 1,5-2 раза.
В присутствии BSA вконцентрации 0,5% и более неспецифическая сорбция снижается в 1,5-2 раза в широкомдиапазоне изменения концентрации антител (до 1 мкМ). Большее снижение неспецифическойсорбции наблюдается при одновременном присутствии Твина-20 и BSA (Рис. 47B). Так присодержании BSA 0,5% и более в присутствии 0,05% Твина-20 неспецифическая сорбцияснижается в 2,5 раза по сравнению с PBS. Большее снижение неспецифической сорбциинаблюдается при одновременном присутствии 0,05% Твин-20 и BSA (Рис. 47B). Так присодержании BSA более 0,5% в присутствии 0,05% Твин-20 неспецифическая сорбция снижаетсяв 2,5 раза по сравнению с PBS.A.B.3,012342,01,51,00,50,00,00012342,5A450, опт.
ед.A450, опт. ед.2,53,02,01,51,00,50,010,1[Ab], мкМ10,00,0000,010,11[Ab], мкМРис. 47. Зависимость величины неспецифического сигнала, полученного в результатевзаимодействия люциферазы с иммобилизованными антителами к прогестерону от ихконцентрации в реакционной смеси при различных концентрациях BSA в отсутствие (A) и вприсутствии 0,05% Твин-20 (B).
Содержание BSA, %:1-0; 2- 0,1; 3- 0,5; 4- 1. Концентрациялюциферазы 1 мкг/мл.Согласно литературным данным [203], добавление BSA предотвращает инактивациюлюциферазы в растворе обусловленную ее неспецифической сорбцией на поверхностиреакционного сосуда, которая вносит существенный вклад в уменьшение биолюминесцентногосигнала при работе с наномолярными концентрациями фермента. Добавки BSA стабилизируют110люциферазу в растворе, сохраняя биолюминесцентный сигнал постоянным во времени (Рис.48). Мы изучили зависимость активности люциферазы от состава буферного раствора.
Дляэтого раствор Luc в концентрации 1 нМ инкубировали в различных буферных растворах при37°С, затем добавляли субстратную смесь ATP- LH2 и регистрировали активность фермента.120I/I0, %1008060PBS40PBST20PBST-BSA00510152025t, минРис. 48. Зависимость активности люциферазы от продолжительности ее инкубации вбуферных растворах PBS, PBST, PBST-BSA. Условия: 1нМ люциферазы, 37°С.
I0биолюминесцентный сигнал Luc в буфере PBST-BSA в начальный момент времени.Как показано на Рис. 48, в буфере PBST-BSA после 20 минут инкубации сохраняетсяболее 97% исходной активности люциферазы, в PBST - 83%, а в PBS всего 75%. Впоследующих экспериментах для инкубации конъюгатов Luc-Pg с Fl-Ab использовали буферPBST-BSA, содержащий 0,05 % Твин-20 и 1% BSA.Таким образом, разработаны методы синтеза конъюгатов люцифераза-прогестерон иконъюгатов антител с красителем Alexa-Fluor 610-x. Показана высокая биолюминесцентнаяактивность Luc-Pg и способность к взаимодействию с конъюгатами Fl-Ab, содержащими от 2до 12 молекул красителя на 1 молекуле антитела, обладающими способностью специфическисвязывать прогестерон. На примере конъюгатов RLuc-Pg и Fl-Ab продемонстрированрезонансный перенос энергии. Однако для «красной» формы люциферазы наблюдался большойвклад фоновой интенсивности при 630 нМ, что затрудняло его применение в BRET- анализе,поэтому дальнейшие исследования мы проводили с использованием «зеленой» формылюциферазы (GLuc) с максимумом биолюминесценции при 550 нм.4.4.4.Оптимизация условий регистрации BRET-сигнала и анализапрогестеронаЗависимость величины BRET-сигнала от концентрации донора и акцептора.
Дляопределения оптимальных условий регистрации BRET-сигнала, были получены зависимостивеличины BRET-сигнала от концентрации пары донор/акцептор. В качестве донораиспользовали конъюгат GLuc-Pg, полученный при соотношении 1:20 в реакционной смеси. В111качестве контроля была использована исходная люцифераза GLuc. В качестве донораиспользовали конъюгат Fl-Ab состава 10:1.Согласно литературным данным [156], неспецифические взаимодействия донорасакцептором описываются линейной зависимостью BRET от концентрации акцептора, аспецифические взаимодействия - зависимостью с насыщением. Таким образом, при измеренияхBRET фоновый сигнал необходимо вычитать из общего регистрируемого сигнала BRET.
НаРис. 49 показаны зависимости BRET-сигнала для GLuc-Pg и GLuc от концентраций Fl-Ab. Накривой для GLuc увеличение BRET-сигнала при росте концентраций акцептора являетсяследствием неспецифических взаимодействий (фонового сигнала),а для кривой GLuc-Pgувеличение BRET-сигнала - результат суммы специфических взаимодействий антителопрогестерон в составе конъюгата и неспецифической сорбции окрашенных антител наповерхности люциферазы.0,4I630/I5500,350,3GLuc-Pg0,25GLuc0,20,150100200300400[Fl-Ab, нМ]Рис.
49. Зависимость BRET-сигнала от концентрации антител, меченных красителем, дляконъюгата GLuc-Pg и исходной люциферазы GLuc. Условия: 2 нМ Luc или Luc-Pg, 37 oC, времяинкубации – 30 мин.На Рис. 50 представлены зависимости BRET-сигнала от концентрации парыдонор/акцептор с вычетом фонового сигнала, из которых следует, что с уменьшениемконцентрации GLuc-Pg максимальная величина BRET-сигнала наблюдается при меньшихконцентрациях Fl-Ab. Так при увеличении концентрации конъюгата GLuc-Pg от 2 нМ до 200нМ при постоянной концентрации Fl-Ab (100 нМ) BRET-сигнал уменьшается в 9 раз.11210,10BRET, I630/I550-фон20,0830,0640,0450,020,00050100150200250300350400[Fl-Ab], нМРис. 50. Зависимость BRET-сигнала от концентрации Fl-Ab при различныхконцентрациях Luc-Pg, нM: 2 (1), 7 (2), 20 (3), 70 (4), 200 (5), 37oC, время инкубации – 30 мин.BRET рассчитан как I630/I550 для Luc-Pg- I630/I550 для Luc.Из полученных данных Рис.
50 можно сделать вывод, что при низких концентрацияхдонора и акцептора, BRET-сигнал составляет 60 - 90% от максимального, следовательно,именно при этих концентрациях (выделенная область) наблюдается минимальный фон примаксимальном значении специфического сигнала:[ GLuc- Pg],нМ2720Дляконцентрацийградуировочныедоноразависимостии[ Fl- Ab], нМ50, 100, 200100, 200100акцептора,измененияуказанныхBRET-сигналаотвыше,быликонцентрацииполученысвободногопрогестерона.
Для этого в лунки планшета вносили 10 мкл раствора GLuc-Pg, добавляли 40 мклраствора, содержащего свободный прогестерон и 10 мкл раствора Fl-Ab. Полученную смесьинкубировали, добавляли субстратную смесь ATP-LH2, регистрировали интенсивностьлюминесценции при 550 и 630 нм и рассчитывали BRET-сигнал (I630/I550).
В данном случаевеличина BRET-сигнала обратно пропорциональна концентрации свободного прогестерона,образующего специфический комплексPg---Fl-Ab без переноса энергии. За 100 % сигналпринимали максимальное значение BRET-сигнала в отсутствие свободного прогестерона (Рис.51, Рис. 52).1131234562BRET, %100139080654700.0110100100010000100000[Pg], нг/млРис. 51. Градуировочные зависимости для свободного прогестерона при различныхконцентрациях пары донор-акцептор, нМ: [GLuc-Pg] = 2 (кривые 1-3), 7 (кривые 4,5), 20 (кривая6); [Fl-Ab]=50 (кривая 3), 100 (кривые 2,5,6), 200 (кривые 1,4).
Условия: время инкубации 30мин при 37°C.Как показано на Рис. 51, при 100 нМ Fl-Ab и высокой концентрации донора (20 нМ)(кривая 6) сужается динамический диапазон изменения BRET-сигнала при анализе свободногопрогестерона по сравнению с кривыми 1, 2, 4, 5, для которых концентрация донора составляют2 и 7 нМ.
Кроме того, с уменьшением концентрации донора, уменьшается концентрацияакцептора,необходимаядляобеспечениямаксимальногодинамическогодиапазонаопределения прогестерона, и, как следствие, снижается фоновый сигнал. Для дальнейшихэкспериментов использовали минимальную концентрацию Luc-Pg (2 нМ), при которойбиолюминесцентный сигнал в 10 раз превышает сигнал фона прибора.Для нахождения оптимальной концентрации Fl-Ab при концентрации GLuc-Pg 2 нМбыли получены градуировочные кривые для определения прогестерона при концентрациях FlAb от 12 до 200 нМ в реакционной смеси.
Как показано на Рис. 52, при уменьшенииконцентрацииFl-Abчувствительностьопределенияпрогестеронаувеличивается,нодинамический диапазон изменения BRET-сигнала уменьшается.1142100BRET, %90123456158034700,0110100100010000[Pg], нг/млРис. 52. Градуировочные кривые для определения свободного прогестерона приразличных концентрациях Fl-Ab, нМ: 1- 200, 2 - 100, 3 - 50, 4 - 25, 5 - 12, Условия: 2 нМ GLucPg, инкубация 30 мин при 37 °CАнализ данных на Рис. 51 и Рис. 52, показал, что оптимальные концентрации донора иакцептора для достижения высокой чувствительности и приемлемого динамического диапазонасоставили 2 нМ и 50 нМ соответственно. Полученные концентрации в 5 и 10 разсоответственно меньше, чем в работе японских ученых, где описан гомогенный конкурентныйиммуноанализ myc пептида на основе BRET [161] (см. обзор литературы).
В работе [161]концентрация донора (гибридный белок глутатион-S трансфераза-myc пептид-люциферазасветляков) составляла 10 нМ, а антител, меченых цианиновыми красителями - 500 нМ.ВлияниетемпературыидлительностиинкубациинаBRET-сигналичувствительность определения прогестерона. Далее было изучено влияние температуры насоотношение I630/I550 для пары донор-акцептор (кривая GLuc-Pg) и на фоновый сигнал,обусловленный неспецифическим взаимодействием GLuc и Fl-Ab (кривая GLuc).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
