Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение (1105561), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Полученные данные представлены Рис. 59.Согласно полученным данным, минимальная определяемая концентрация прогестерона впробе составляет 0,5 нг/мл, что эквивалентно 1,7 нМ, это в 6 раз меньше, чем в работе [161] , вкоторой Yamakawa с соавторами использовали похожую схему гомогенного конкурентногоиммуноанализа низкомолекулярного myc-пептида с использованием антител, меченыхцианиновым красителем Cy 3.5 и гибридного белка люциферазы светляков Luciola lateralis с сmyc пептидом, описанную ранее.12112BRET, I630/I5500.240.210.180.01101001000[Pg],нг/млРис. 59. Зависимости BRET-сигнала от концентрации свободного прогестерона дляконъюгата GLuc-Pg (1), и исходной люциферазы GLuc (2).4.4.5.Гетерогенный иммуноанализ прогестерона с использованиембиолюминесцентного метода детекцииВ этом разделе проведено сравнение чувствительности гомогенного иммуноанализа наоснове BRET с традиционным гетерогенным конкурентным иммуноанализом с использованиемтех же конъюгатов люцифераза-прогестерон.Традиционный иммуноанализ с использованием конъюгатов GLuc-Pg проводили последующей схеме.
На поверхность полистирольного планшета иммобилизовали кроличьиполиклональные антитела к прогестерону, обрабатывали раствором PBS-BSA и наносили смесь,содержащую GLuc-Pg и Pg. После удаления несвязавшихся компонентов добавлялисубстратную смесь ATP-LH2 и регистрировали интенсивность биолюминесценции, котораябыла пропорциональна количеству связавшегося с антителами конъюгата и обратнопропорциональна концентрации свободного Pg.Из литературы известно, что для эффективной иммобилизации антител используетсябелок А [204], который образует связь с Fc-фрагментами антител, способствуя упорядоченнойориентации антител и тем самым увеличению доступности вариабельных фрагментов,отвечающих за связывание с антигеном.
В связи с этим было проведено сравнениеэффективности специфической иммобилизации антител из буфера PBS на белок А,предварительно нанесенный на планшет, и неспецифической иммобилизации антител наполистирольный планшет из карбонатного буфера. Для выявления комплекса Ab-белок А122использовали GLuc-Pg в концентрации от 8 до 32 нМ, наРис. 60 представлены кривые,полученные при 8 и 32 нМ GLuc-Pg .1400001200001234100000I, RLU8000060000400002000000,00 0,1110[Ab], мкг/млРис.
60. Зависимости биолюминесцентного сигнала от концентрации антител,иммобилизованных на поверхность полистирольного планшета, обработанную (кривые 1, 2) инеобработанную белком А (кривые 3, 4), полученные при различных концентрациях GLuc-Pg:32 нМ (кривые 1, 3) и 8 нМ (кривые 2, 4). Условия: 2 мкг/мл белок А, в буфере NCA,инкубация с GLuc-Pg в течение 1 ч при 37°ССогласно полученным результатам, при использовании белка А биолюминесцентныйсигнал возрастает в 2 - 2,5 раза, поэтому для дальнейших экспериментов проводилинаправленную иммобилизацию антител на поверхность, обработанную белком А.Для конкурентного иммуноанализа максимальной чувствительностью обладает система,в которой концентрация антител, за центры связывания с которыми идет конкуренция,значительно меньше, чем концентрация антигена (аналита) и меченого (конкурирующего)антигена.
При этом концентрация меченого антигена должна позволять детектироватьдостоверный воспроизводимый сигнал и быть соизмерима с концентрацией антигена. С другойстороны, кривая титрования активных центров антигена антителами - кривая с насыщением,поэтому максимальная чувствительность анализа будет наблюдаться при концентрациях парыантиген/антитело, попадающих в диапазон изменения сигнала 20 - 80% от максимального.Для выявления концентраций Ab и GLuc-Pg, удовлетворяющих перечисленнымкритериям проводили шахматное титрование.
Растворы антител с концентрациями в диапазоне0,1-10 мкг/мл наносили на планшет с иммобилизованным белком А, несвязавшиесякомпоненты удаляли, и вносили растворы содержащие GLuc-Pg в концентрациях 2, 4, 8 нМ иинкубировали;непрореагировавшийGLuc-Pgудаляли,послечегорегистрировалибиолюминесцентный сигнал. Полученные данные представлены на Рис. 61.12360123I.10-3, RLU402000,00 0,1110[Ab], мкг/млРис. 61.Зависимости биолюминесцентного сигнала от концентрации антител,иммобилизованных на полистирольном планшете при различных концентрациях GLuc-Pg, нМ:8 (кривая 1), 4 (кривая 2), 2 (кривая 3)Как показано на Рис. 61, при использованных концентрациях антител насыщениенаблюдается только при концентрации GLuc-Pg равной 2 нМ.
При данной концентрациинаблюдается биолюминесцентный сигнал, достаточный для проведения анализа, поскольку ужепри концентрации антител 0,5 мкг/мл специфический сигнал более чем в 100 раз превышаетсигнал фона. При концентрациях GLuc-Pg 4 и 8 нМ насыщение наблюдается при концентрацииантител более 10 мкг/мл. При таких высоких концентрациях антител можно ожидатьзначительное снижение чувствительности анализа.
Поэтому в дальнейших экспериментах пооптимизации методики анализа была использована концентрация GLuc-Pg 2 нМ иконцентрации антител 4, 2, 0,7, 0,5 мкг/мл. Были получены градуировочные кривые дляопределения Pg в диапазоне концентраций от 0 до 1000 нг/мл (Рис. 62).Как показано на Рис. 62 снижение концентрации иммобилизованных антител до 0,7мкг/млприоднойитойжеконцентрацииGLuc-Pgприводиткуменьшениюбиолюминесцентного сигнала (Рис. 62 А кривые 0,7 и 0,5). При этом увеличиваетсячувствительность анализа. Так при концентрации Pg 1нг/мл и Ab 4 мкг/мл биолюминесцентнаяинтенсивность составляет 100 % от интенсивности в отсутствие прогестерона, приконцентрации антител 0,7 мкг/мл и той же концентрации прогестерона биолюминесцентнаяинтенсивность снизилась до 88 %. Дальнейшее снижение концентрации антител до 0,5 мкг/млне приводит к увеличению чувствительности метода.124А.B.10016000420,70,51200010000I, RLU420,70,580I/I0, отн.
ед.14000800060006040400020200000,00 0,111010000,00 0,110001[Pg], нг/мл101001000[Pg], нг/млРис. 62. Градуировочные зависимости биолюминесцентного сигнала в RLU (А) или в %(B) от концентрации прогестерона при различных концентрациях иммобилизованных антител4, 2, 0,7, 0,5 мкг/мл и 2 нМ конъюгата GLuc-PgДля дополнительного увеличения чувствительности анализа был увеличен объемвводимой пробы свободного прогестерона в 10 раз при сохранении концентрации GLuc-Pg винкубационной смеси, что позволило снизить передел обнаружения с 3 до 0,3 нг/мл.На Рис.
63 показано сравнение чувствительности двух методов анализа, проведенных воптимизированных для каждого метода условиях. В Таблице 19 приведены их аналитическиехарактеристики.100100128090I/I0B/B06040802000,001101001000[Pg],нг/млРис. 63. Градуировочные зависимости относительного биолюминесцентного (I/I0) илиBRET (B/B0) сигналов от концентрации прогестерона для гетерогенного (кривая 1) игомогенного (кривая 2) иммуноанализа прогестерона с использованием конъюгатов GLuc-Pg.Условия гомогенного иммуноанализа: состав реакционной смеси 1 нМ GLuc-Pg, 25 нМ Fl-Ab,объем пробы прогестерона 100 мкл, буферный раствор PBST-BSA, инкубация при 23°C 20 мин.Условия гетерогенного иммуноанализа: 0,7 мкг/мл нМ Ab, 2 нМ GLuc-Pg в инкубационнойсмеси после добавления пробы, 100 мкл раствора пробы125Таблица 19.
Аналитические характеристики гомогенного и гетерогенного иммуноанализа.ГомогенныйГетерогенныйЛинейный диапазон0,3-30 нг/мл0,1-100 нг/млУравнениеB/B0 = -4,913ln(С) + 93,465I/I0 = -15,24ln(С) + 62,824R20,9920,995Предел обнаружения0,5 нг/мл0,3 нг/млСогласно полученным данным, метод, разработанный на основе BRET, обладаетпрактически идентичной чувствительностью, что и гетерогенный конкурентный иммуноанализс использованием тех же конъюгатов с незначительным увеличением предела обнаружения с0,3 до 0,5 нг/мл.
При этом время анализа сокращается с 1 часа до 15 минут, значительноуменьшается трудоемкость анализа. Анализ проводится при комнатной температуре и нетребует специальной обработки планшета по сравнению с гетерогенным иммуноанализом, гдетребуются стадии сорбции белка А, антител и промывания планшета после специфическойреакции.Таким образом, разработан метод гомогенного иммуноанализа прогестерона на основебиолюминесцентного резонансного переноса энергии с использованием конъюгатов на основелюциферазы светляков L.
mingrelica в качестве донора. Показано, что его применениесокращает время анализа и трудоемкость по сравнению с традиционным гетерогеннымиммуноанализом с использованием люциферазы в качестве метки.1265. ВЫВОДЫ1) Сконструирована плазмида, кодирующая гибридный белок высокоактивноготермостабильного мутанта люциферазы Luciola mingrelica с биотин-связывающим доменом(Luc-bccp-His6), при экспрессии которой в клетках E. coli с высоким выходом полученгибридныйбелокLuc-bccp,биотинилированныйinvivo,обладающийвысокойбиолюминесцентной активностью и способностью связывать стрептавидин. Показано, чтокаталитические свойства, термостабильность и спектры биолюминесценции гибридного белкаLuc-bccp и исходной люциферазы идентичны.2) Сконструированы плазмиды, кодирующие гибридные белки высокоактивноготермостабильного мутанта люциферазы Luciola mingrelica со стрептавидином (SA-Luc-His6, SALuc-His6 M/G, His6-SA-Luc, Luc-SA-His6).
Показано, что олигомерный состав, люциферазнаяактивность и сродство к биотину гибридных белков, полученных при экспрессиисконструированных плазмид, зависят от взаимного расположения доменов люциферазы,стрептавидина и His6 последовательности. Показано, что гибридный белок His6-SA-Lucобразуется преимущественно в тетрамерной форме, обладающей высокой люциферазнойактивностью и высоким сродством к биотину. Эти свойства определяют перспективность егоиспользованиявбиоаналитическихсистемахнаосновебиотин-стрептавидиновыхвзаимодействий.3) Показано, что гибридный белок His6-SA-Luc является высокоэффективным реагентомпри специфической детекции клеток микроорганизмов на основе биотин-стрептавидиновыхвзаимодействийкаксиспользованиемиммуноанализа,такисиспользованиемгибридизационного анализа специфических последовательностей сегментов ДНК клетокмикроорганизмов.7) Создана новая система для эффективного биолюминесцентного резонансногопереноса энергии на основе конъюгатов термостабильного мутанта люциферазы с антигеном иконъюгатов красителя Alexa-Fluor с антителами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
