Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение (1105561), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Плазмиды 1 и 2отличались тем, что в плазмиде 2 в гене люциферазы стартовый кодон Met был заменен на Glyво избежание возможной коэкспрессии свободной люциферазы без стрептавидина. Структурыплазмид, подтвержденные методом секвенирования, показаны на Рис. 14.1, 234Рис. 14. Структуры плазмид, кодирующих гибридные белки люцифераза-стрептавидин.Обозначения: 1- SA-Luc-His6, 2- SA-Luc-His6 M/G, 3- His6-SA-Luc, 4- Luc-SA- His6764.2.2. Получение гибридных белков люцифераза-стрептавидинПолученные плазмиды были наработаны в клетках E.coli XL1 Blue.
Экспрессиюполученных плазмид проводили в клетках E.coli BL21(DE3). Выращивание и лизис биомассыклеток проводили по методу [172]. Гибридные белки очищали методом металлохелатнойхроматографии. Результаты представлены в Таблице 14.Таблица 14. Свойства препаратов гибридных белков люцифераза-стрептавидинСвойстваочищенныхпрепаратовАктивность×10−12, RLU/мгВыход, мг/200мл средыСвязывание сколонкой, %SA-LucHis6Гибридные белкиSA-LucHis6-SAHis6 M/GLucЛюциферазаLuc-SAHis6Luc3,2±0,82,2±0,22,4±0,11,0±0,16,8±0,13,8±0,72,9±0,22,6±0,11,9±0,122,5±0,396 ± 386± 477±135±589Высокий процент связывания белков с Ni-сефарозой при очистке указывает надоступность His6 для связывания с сорбентом.
Существенное снижение связывания Luc-SA-Нis6может быть объяснено особенностями структуры данного гибридного белка, снижающимидоступность Нis6 для связывания с колонкой. Значительное снижение выхода гибридных белковпо сравнению с выходом исходной люциферазы (Таблица 14), может объясняться токсичнымвлиянием стрептавидина на клетки E. coli. Тем не менее, белки нарабатывались в достаточномдля их дальнейшего исследования количестве, и для их экспрессии не требовалосьиспользования шаперонов в отличие от работы [110], где экспрессию проводили в присутствиипоследних. Удельные активности препаратов гибридных белков SA-Luc-His6, SA-Luc-His6M/Gи His6-SA-Luc составили 30-50% от активности исходной люциферазы и были в два раза выше,чем активность Luc-SA- His6.SDS-электрофорез в полиакриламидном геле очищенных гибридных белков (Рис.
15)показал, что для SA-Luc-His6 и SA-Luc-His6 M/G наблюдалось две полосы: гибридного белка илюциферазы, что свидетельствовало о наличии в препарате свободного фермента (Рис. 15,образцы (1) и (2)).Гибридные белки His6-SA-Luc и Luc-SA-His6 не содержали свободнойлюциферазы, поскольку His6 был связан с доменом стрептавидина (Рис. 15, образцы (3) и (4)).77Рис. 15. SDS-электрофорез в 10% полиакриламидном геле для исходной люциферазы игибридных белков люцифераза-стрептавидин.
Проявление гелей выполняли с помощьюкрасителя бромфенолового синего. Обозначения: (0) - люцифераза, (1) - SA-Luc-His6, (2) - SALuc-His6 M/G, (3) –His6-SA-Luc, (4) - Luc-SA- His64.2.3. Свойства гибридных белков люцифераза-стрептавидинИзвестно [187], что стрептавидин может существовать в форме различных олигомеров(димеров,тетрамеров,октамеров),обладающихспособностьюсвязыватьбиотин.Опубликованы лишь единичные работы, в которой изучался олигомерный состав гибридныхбелков (стрептавидин-антитело), содержащих стрептавидин [188]. Важно было выяснить, содной стороны, влияние домена люциферазы на олигомеризацию стрептавидина и его биотинсвязывающуюактивность,асдругойстороны,влияниеструктурыолигомера наферментативную активность люциферазы.
Выяснение взаимосвязи между структурой исвойствами гибридных белков люцифераза-стрептавидин было необходимо и для выборагибридногобелкаснаилучшимихарактеристикамипоактивностилюциферазыистрептавидина.Эксклюзионнаяхроматографияочищенныхметаллохелатнойхроматографиейпрепаратов гибридных белков люцифераза-стрептавидин (Рис. 16) показала, что препаратысодержат несколько фракций: мономеры, димеры, тетрамеры и высокомолекулярныеолигомеры, а в некоторых случаях наблюдается присутствие и свободной люциферазы.Для каждой из полученных фракций были определены относительное содержаниекаждой олигомерной формы в составе белкового препарата (Рис.
17А), удельная люциферазнаяактивность (Рис. 17Б) и способность связывать биотин (Рис. 17В)78Высокомолек. фракция7060A, mUA50тетрамеры40димеры30Люцифераза201004681012141618202224v, mlРис. 16. Пример хроматограммы, полученной для SA-Luc-His6 M/G на колонке Superose 1210/30 GL.
Условия: скорость потока 0,3 мл/мин, объем пробы 100 мкл, λ=280 нм, подвижнаяфаза 50 мМ Tris-ацетат, 100 мМ Na2SO4, pH 7,8Рис. 17. Свойства различных форм гибридных белков люцифераза-стрептавидин: А –относительное содержание (отношение интегральной оптической плотности данной формы ксуммарному интегралу оптической плотности для данного гибридного белка); Б - удельнаялюциферазная активность (отношение максимальной интенсивности биолюминесценции кконцентрации соответствующей формы белка, RLU/мг); В – способность связываться сбиотином (отношение интенсивности биолюминесценции олигомерной формы, связанной симмобилизованным биотинилированным BSA, к интенсивности биолюминесценции исходногораствора данной формы, %).79Оказалось,чтовысокомолекулярныеSA-Luc-His6фракции.M/GДляиLuc-SA-His6SA-Luc-His6преимущественноотносительноеобразуютсодержаниевысокомолекулярных олигомеров и тетрамеров близко, а His6-SA-Luc преимущественнообразует тетрамеры.
Для гибридных белков SA-Luc-His6, His6-SA-Luc, SA-Luc-His6M/Gмаксимальной удельной активностью люциферазы обладают тетрамеры, а для Luc-SA-His6 –высокомолекулярные олигомеры. Содержание и удельная активность свободной люциферазымаксимальны для SA-Luc-His6, а для SA-Luc-His6 M/G эти величины в ~2 раза ниже.Способность связываться с биотинилированным BSA, иммобилизованным на поверхностилунок планшета, была определена как отношение люциферазной активности гибридного белка,удерживаемогонаповерхностизасчетвысокоаффинныхбиотин-стрептавидиновыхвзаимодействий, к люциферазной активности исходного раствора гибридного белка. В качествеконтроля использовали планшеты с иммобилизованным небиотинилированным BSA (в данномслучае связывание составляло менее 0,1 %).
Показано, что максимальной способностьюсвязываться с биотином обладают фракции димеров и тетрамеров. Высокомолекулярныефракции связываются с биотином в 4 раза хуже, чем тетрамеры и димеры гибридных белков.Влияние структуры плазмид на состав и свойства гибридных белков. Структуралинкера между стрептавидином и люциферазой должна обеспечивать сохранение свойств двухсоединяемых белков. Ранее в качестве линкеров для связывания легких и тяжелых цепейантител были использованы последовательности (GGGGS)3 [189] и SSA(DDAKK)4DG [190]. Вданной работе мы использовали более короткие подвижные линкеры SGGGS и SGGGGSA.
Какпоказал хроматографический анализ продуктов, очищенных металлохелатной хроматографией(рис. 4), при использовании плазмиды SA-Luc-His6 около 30% белка, обладающегобиолюминесцентной активностью, находилось в форме свободной люциферазы, причем именнолюцифераза определяла активность полученного препарата.Присутствие свободнойлюциферазы может быть связано с коэкспрессией свободной люциферазы и/или с деградациейгибридного белка в процессе его получения. Замена стартового кодона Met на Gly в начале геналюциферазы (плазмида SA-Luc-His6M/G) привела к снижению содержания свободнойлюциферазы в 2 раза по сравнению с SA-Luc-His6.В плазмиде (His6-SA-Luc)последовательность His6 была перемещена с С-конца гена люциферазы на N-конец генастрептавидина. В этом случае при металлохелатной хроматографии гибридный белок отделялсяот всех компонентов, не содержащих His6, в том числе и от свободной люциферазы, если дажеона и экспрессировалась.
Белок Luc-SA-His6, который кодировался плазмидой, содержащей генстрептавидина на С-конце люциферазы и His6 на С-конце стрептавидина, также не содержалсвободной люциферазы.80Тетрамерные формы гибридных белков обладали наибольшей биолюминесцентной ибиотинсвязывающей активностью (Рис. 17Б и В), поэтому для них были получены спектрыбиолюминесценции, и была измерена термостабильность. Добавление домена стрептавидина,как оказалось, не повлияло на спектры биолюминесценции, однако снизило термостабильностьв два раза (Рис. 18).Б.A.01,00,8Lg(I/I0), отн.
ед.I/Imax, отн.ед.-0,20,60,40,2-0,4-0,6-0,8-1-1,20,0450,0550,0650,0λ, нмLucSA-Luc-His6 M/GSA-Luc-His6SA-Luc-His6-1,40510время, минLucSA-Luc-His6 M/G15SA-Luc-His6SA-Luc-His6Рис. 18. Спектры биолюминесценции и кривые инактивации для тетрамерных формгибридных белков. Условия инактивации: концентрация Luc-SA или Luc 0,01 мг/мл в буфереTB1 при 47°CНа основании полученных данных можно сделать вывод о том, что структура плазмидысущественно влияет на соотношение олигомерных форм, а также на активность люциферазы истрептавидина в составе гибридного белка.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
