Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение (1105561), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Повсоставеконъюгатаобразовывать150 мкл растворов Luc-Pg или Luc вконцентрации 1 мкг/мл в PBS помещали в лунки полистирольного планшета и инкубировали втечение ночи при +4 °С, затем лунки планшета промывали 5 раз по 200 мкл PBST. Далее влунки планшета вносили по 100 мкл раствора первичных поликлональных кроличьих антител кпрогестерону в буферном растворе PBST с концентрациями от 35 мкг/мл до 0,5 мг/мл с шагомразбавления 3, инкубировали в течение 1 часа при 37 °С без перемешивания с последующейпромывкой планшета 3 раза по 200 мкл PBST.
Далее в лунки планшета помещали 100 мклконъюгата вторичных антител (козел против кролика) с пероксидазой хрена, разбавленных в1000 раз в буферном растворе PBST, инкубировали в течение 1 часа при 37 °С, безперемешивания с последующей промывкой планшета 3 раза по 200 мкл PBST. Затем вносили100 мкл тетраметилбензидина (ТМБ), инкубировали в течение 10 мин при комнатнойтемпературе, в темноте, добавляли 100 мкл стоп-реагента (1M H2SO4) и измеряли A450 завычетом фона (A650).Определение состава конъюгатов Luc-Pg.
Для определения количества молекул Pg,связанных с молекулой Luc, были измерены спектры поглощения прогестерона, люциферазы и66конъюгатов Luc-Pg в интервале длин волн 240-300 нм. При анализе спектров поглощенияконъюгатов использовали разложение спектра конъюгата на нормированные спектрыпоглощения прогестерона и люциферазы, умноженные на соответствующие коэффициенты,найденные путем решения системы уравнений:280 ∗ + 280 ∗ = 280набл{250 ∗ + 250 ∗ = 250наблГде 280 = 0.006, 280 = 1; 250 = 1, 250 = 0,37280набл и 250набл - наблюдаемые значения оптической плотности изучаемого раствораконъюгата при 280 и 250 нм.
Коэффициент экстинкции прогестерона при 250 нм определялипутем измерения его спектра поглощения при концентрации 15 нМ. Отношение Pg:Lucрассчитывали по уравнению:: =x: Где εPg и εLuc- коэффициенты экстинкции прогестерона и люциферазы, равные 1,6∙104 и 3,4∙104М-1см-1 соответственно.Получение конъюгатов Fl-Ab на основе красителя Alexa- fluor 610-xНавеску красителя (Fl) растворяли в 15 мкл ДМСО и спектрофотометрическиопределяли его концентрацию по A610, исходя из ε=138000 М-1см-1, MW= 1284.Реакцию проводили по аминогруппам антител с использованием сукцинимидного эфиракрасителя.
Раствор поликлональных кроличьих антител, концентрацией 35 мг/мл разбавляли доконцентрации 4 мг/мл в буфере PBS, добавляли раствор красителя Alexa-fluor в ДМСО такимобразом, чтобы молярные соотношения Ab: Fl в реакционной смеси составляли 1:5, 1:10, 1:20,1:25, 1:30. Реакционную смесь инкубировали при 37°C при перемешивании со скоростью 250об/мин в течение 1,5 часов. Окрашенные антитела отделяли от избытка красителя с помощьюмикро-био-спин-колонки, заполненной носителем Sephadex G-25, уравновешенной буферомPBS, согласно инструкции производителя.
Количество связавшегося красителя определяли поA610.Способность окрашенных антител связывать антиген определяли по той же схеме,что и способность прогестерона в составе конъюгата Luc-Pg связывать антитела. При этомвместо неокрашенных первичных антител использовали антитела с различным содержаниемкрасителя.ЗависимостьэффективностиBRETсигналаотмолярногосоотношениякраситель/антитело для окрашенных антител.
Реакционную смесь объемом 50 мкл,содержащую 3,3·10-8 М RLuc-Pg (конъюгат состава RLuc:Pg = 1:10) или 3,3·10-8 М RLuc(контроль) и 3·10-7 М Fl-Ab различной степени окрашивания или Ab (контроль) инкубировали67при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте, затем добавляли 50 мкл субстратнойсмеси ATP-LH2, перемешивали, регистрировали интенсивности биолюминесценции при 630 нмк 590 нм на спектрометре Spectramax M5 и рассчитывали BRET-сигнал как отношение I630 к I590.Все инкубации с окрашенными антителами в дальнейших экспериментах проводили в темнотепри перемешивании со скоростью 250 об/мин.Оптимизация условий регистрации BRET-сигналаИзмерениеинтенсивностибиолюминесценциииBRET-сигнала.Влункистрипованного планшета вносили по 50-120 мкл изучаемого раствора, содержащего Luc илиLuc-Pg, добавляли 50 мкл субстратной смеси ATP-LH2, регистрировали общую интенсивностьбиолюминесценции и интенсивности при 550 и 630 нм, на приборе Spectramax M5.
BRETсигнал рассчитывали как отношение I630 к I550.Изучение влияния ПАВ на неспецифический сигнал. Реакционную смесь объемом 50мкл, содержащую 1,3 нМ Luc и 130 нМ Fl-Ab в буферном растворе, содержащем 1% BSA исоответствующие добавки ПАВ, инкубировали при 37°C в течение 45 минут и измерялиинтенсивность биолюминесценции и BRET-сигналОптимизация концентраций реагентов GLuc-Pg и Fl-Ab. К 40 мкл растворов GLuc-Pgразличной концентрации объемом добавляли 10 мкл раствора Fl-Ab, в качестве контроляиспользовали растворы с теми же концентрациями компонентов, но вместо GLuc-Pgиспользовали GLuc.
Полученные смеси инкубировали при +37°C в течение 30 минут в буфереPBST-BSA и измеряли интенсивность биолюминесценции и BRET-сигнал.Изучение влияния длительности инкубации на биолюминесцентный сигнал и BRET.60 мкл раствора GLuc-Pg с концентрацией 2 нМ или 60 мкл смеси, содержащей 2 нМ GLuc-Pg и50 нМ Fl-Ab, инкубировали при 37 °C в течение 30, 60, 90 и 120 минут и измерялиинтенсивность биолюминесценции и BRET-сигнал.Влияние температуры на биолюминесцентный и BRET сигналы и кинетикуобразования специфических и неспецифических взаимодействий изучали с использованиемрастворов следующего состава:№ р-ра123GLuc-PgGLuc-Pg+ Fl-AbGLuc+ Fl-AbКонцентрациялюциферазы, нМКонцентрация Fl-Ab,нМ2225050Времяинкубации,мин103030Влияние температуры на биолюминесцентный сигнал изучали с использованиемраствора № 1, влияние температуры на образование специфических и неспецифических68взаимодействий изучали с использованием растворов № 2 и № 3.
Полученные растворыобъемом 60 мкл вносили в лунки белого стрипованного планшета, инкубировали в течениеуказанных промежутков времени при 4 °С, 23 °С, 37 °С. При изучении кинетикивзаимодействия GLuc-Pg с Fl-Ab раствор №2 инкубировали в течение 2, 5, 10, 15, 20 и 30 минутпри этих же температурах. Затем измеряли интенсивность биолюминесценции и BRET-сигнал.Зависимость биолюминесцентного и BRET-сигнала от объема реакционной смеси. К20 мкл реакционной смеси, содержащей 6 нМ GLuc-Pg и 150 нМ Fl-Ab в PBST-BSA, добавляли40,60,80 и100мклPBST-BSA,перемешивали,затемизмерялиинтенсивностьбиолюминесценции и BRET-сигнал.На каждом этапе оптимизации получали градуировочные зависимости измененияBRET-сигнала от концентрации прогестерона. Готовили серию растворов прогестерона вдиапазоне концентраций от 0,3 до 100000 нг/мл в буферном растворе PBST-BSA.
К 40 мклкаждого из полученных растворов прибавляли по 10 мкл раствора Luc-Pg и 10 мкл Fl-Ab вразличных концентрациях, инкубировали в темноте от 2 до 30 минут при 4, 23 или 37 °C взависимости от условий эксперимента. При изучении влияния объема пробы, содержащейпрогестерон, на чувствительность анализа к 20 мкл реакционной смеси, содержащей 6 нМGLuc-Pg и 150 нМ Fl-Ab в PBST-BSA, добавляли 40, 60, 80 и 100 мкл раствора Pg с различнойконцентрацией и инкубировали при 23 °C в течение 20 минут. Затем измеряли интенсивностьбиолюминесценции и BRET-сигнал.Влияние порядка смешения реагентов на градуировочные зависимости BRET-сигналаот концентрации свободного прогестерона. При одновременном смешении реагентов к 20мкл смеси, содержащей 6 нМ GLuc-Pg и 150 нМ Fl-Ab, добавляли 40 мкл раствора Pg вразличной концентрации, инкубировали при 23°C в течение 20 минут иизмерялиинтенсивность биолюминесценции и BRET-сигнал.При последовательном добавлении реагентов использовали два варианта смешения.
Впервом варианте к 40 мкл раствора Pg прибавляли по 10 мкл 300 нМ раствора Fl-Ab,инкубировали при 23°C в течение 10, 15 и 19 минут, затем добавляли 10 мкл 12 нМ раствораGLuc-Pg в PBST-BSA и продолжали инкубацию еще 10, 5 или 2 минуты. Затем измерялиинтенсивность биолюминесценции и BRET-сигнал.Во втором варианте к 10 мкл 300 нМ раствора Fl-Ab в PBST-BSA добавляли 10 мкл 12нМ раствора GLuc-Pg в PBST-BSA. Полученную смесь инкубировали 10 или 15 минут, затемдобавляли 40 мкл раствора Pg с концентрацией от 1 до 1000 нг/мл и продолжали инкубациюеще 10 или 5 минут.
Затем измеряли интенсивность биолюминесценции и BRET-сигнал. Во69всех трех случаях суммарное время инкубации составляло 20 минут. Схема инкубациипредставлена в Таблице 11.Таблица 11. Схема инкубации GLuc-Pg, Pg и Fl-AbПервый вариант смешения1) Инкубация Fl-Ab с Pg, мин2)Инкубация полученной смесис GLuc-Pg, мин1010155191Второй вариант смешения1) Инкубация Fl-Ab с GLuc-Pg, 2) Инкубация полученной смесиминс Pg, мин1010155Получение калибровочных кривых в оптимизированных условиях для определениясодержания прогестерона в пробе. Готовили серию растворов Pg в диапазоне концентрацийот 1 до 1000 нг/мл в буферном растворе PBST-BSA.
К 100 мкл каждого из полученныхрастворов добавляли 20 мкл реакционной смеси, содержащей 6 нМ GLuc-Pg и 150 нМ Fl-Abили 20 мкл реакционной смеси, содержащей 6 нМ GLuc и 150 нМ Fl-Ab (контрольный раствор).Полученные смеси инкубировали при 23 °C в течение 20 минут и измеряли интенсивностибиолюминесценции и BRET-сигнал.3.4.8. Гетерогенный конкурентный иммуноанализ прогестерона сиспользованием биолюминесцентного метода детекцииСорбция антител на полистирольный планшет с использованием белка А.
Растворбелка А в концентрации 2 мкг/мл в буфере NCA (200 мкл) вносили в лунки планшета,инкубировали в течение 2 ч при 37 ˚С, 250 об/мин, затем промывали 3 раза 200 мкл буферомPBST. Далее, вносили по 150 мкл раствора поликлональных антител в различныхконцентрациях в буфере PBS, инкубировали в течение ночи при 4 ˚С и промывали 3 раза по 200мкл PBST.Прямая сорбция антител на полистирольную поверхность. По 200 мкл раствораантител в буфере NCA вносили в лунки планшета, инкубировали в течение ночи при 4˚С ипромывали 3 раза по 200 мкл PBST.После иммобилизации антител в обоих случаях свободную поверхность блокировалираствором PBST-BSA в течение 2 часов при 37 °С, промывали 3 раза 200 мкл PBST ииспользовали для анализа прогестерона.70Определение концентрации свободного прогестерона.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
