Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6 (1105555), страница 8
Текст из файла (страница 8)
2.5.Рисунок 2.5. Анализ модификации белка S6 на разных стадиях цикла роста культуры спомощью иммуноблоттинга с антителами на S6. Дорожки соответствуют образцамсуммарных белков клеток, взятых через указанное время после разбавления в свежейсреде культуры в стационарной фазе.Если при выходе культуры из стационарной фазы роста осуществляется активноеудаление дополнительных остатков глутаминовой кислоты, то в данном эксперименте мынаблюдали бы наличие демодифицированной формы S6. Такой демодификации ненаблюдается, это значит, что интенсивная экспрессия генов рибосомных белков влогарифмической фазе роста приводит к замещению олигоглутамилированного S6 вновьсинтезированным немодифицированным S6.522.2.
Определение субстратной специфичности фермента RimKCубстратом фермента RimK может быть как свободный белок S6, так и S6 всоставе различных рибосомных частиц, 30S, 70S, или 100S.Биоинформатическими методами показано, что в структуре фермента RimKприсутствует РНК-связывающий мотив [79]. Кроме того мы установили, что белок S6модифицируется в стационарной фазе, когда синтез новых рибосом не осуществляется.Оба этих факта позволяют предположить, что субстратом для фермента RimK является несвободный белок S6, а S6 в составе уже собранной рибосомы. Для проверки этой гипотезымы воспользовались разработанной нами cистемой для модификации S6 in vitro.Штамм ∆rimK, в котором отсутствует олигоглутамилирование S6, мы использовалив качестве источника потенциальных субстратов для RimK.
В качестве последних мыиспользовали 70S, 30S и 100S рибосомные частицы из клеток ∆rimK в логарифмической истационарной фазы роста, рибосомные белки, отделённые от рРНК (TP70), а также S30клеточный экстракт. Для сравнения мы аналогичным образом приготовили субстраты изклеток дикого типа.Для детекции модификации S6 рекомбинантным RimK мы использовали14C-глутаминовую кислоту.
После остановки реакции мы разделяли белки в денатурирующемПААГ, гель проявляли с помощью авторадиографии. Результаты показаны на рис. 2.5.Нами было показано (рис. 2.6), что субстратом для RimK может быть только S6 всоставе 30S, 70S или 100S рибосомных частиц. Свободный белок S6 не может бытьмодифицирован. Кроме того in vitro олигоглутамилирование рибосом, выделенных изклеток дикого типа, подтверждает наши результаты о том, что S6 модифицирован тольков стационарной фазе роста клеток. Рибосомы дикого типа, выделенные из клетоклогарифмической фазы роста способны присоединить столько же остатков глутаминовойкислоты, сколько и рибосомы из клеток ∆rimK, в которых олигоглутамилирование S6отсутствует.Этоозначает,чтобелокS6неолигоглутамилированвклеткахлогарифмической фазы роста. В то же время рибосомы дикого типа из клетокстационарной фазы роста способны присоединить заметно меньше глутаминовойкислоты, что говорит о том, белок S6 в них уже содержит дополнительныеаминокислотные остатки (рис.
2.5).53Рисунок 2.6. In vitro модификация белка S6 рекомбинантным ферментом RimK cпомощью радиоактивно меченной глутаминовой кислоты. Авторадиография гелей,содержащих белки из реакционной смеси после завершения реакции. Видимые зонысоответствуют белку S6 со встроенными остатками радиоактивной глутаминовойкислоты. Каждая дорожка соответствует отпределённому субстрату (70S, 30S,100S рибосомы, суммарный рибосомный белок – ТР70, или S30 экстракт).В случае рибосом из клеток ∆rimK количество глутаминовой кислоты,присоединяемой in vitro к белку S6 рекомбинантным RimK постоянно и не зависит отфазы роста клеток, из которых выделили рибосомы.
То есть рибосомы из стационарнойфазы не являются преимущественными субстратами для фермента RimK, рибосомы излогарифмической фазы модифицируются in vitro столь же эффективно.542.3. Влияние олигоглутамилирования белка S6 на процесс трансляцииМы выяснили, что модификация белка S6 происходит в стационарной фазе роста, асубстратом для RimK является S6 в составе рибосомы. Следующий вопрос – на что влияетсама модификация белка S6. Поскольку мы имеем дело с модификацией компонентааппарата трансляции, логично предположить, что олигоглутамилирование белка S6 можетвлиять на работу рибосомы, а значит, может меняться белковый состав клетки.Мы провели сравнительный протеомный анализ суммарного белка из клеток ∆rimKи клеток дикого типа. Поскольку модификация белка S6 наблюдается только встационарной фазе роста, а в активно делящихся клетках она отсутствует, то инаблюдаемые эффекты на суммарный протеом могут быть различными на разных фазахроста.Поэтомумысравнивалибелковыйсоставклетоквстационарнойилогарифмической фазе роста.
Кроме того, интересен переход из стационарной фазы влогарифмическую, ведь в этот период олигоглутамилированный S6, как мы уже выяснили,замещаетсявновьсинтезированнымнемодифицированнымбелкомS6.Клетки,«выходящие» из стационарной фазы также были проанализированы. Белки из клетокдикого типа окрашивали зелёной флуоресцентной краской Cy3, белки из штамма снокаутом – красной краской Cy5. Обе краски ковалентно связываются с боковымиаминогруппами в белках. Образцы наносили на гель и последовательно проводилиэлектрофорез в двух направлениях. Первое направление – изоэлектрофокусировка, второе– ПААГ в денатурирующих условиях.
Результат двумерного электрофореза представленна рис. 2.7.Оказалось, что в клетках штамма ∆rimK уровень биосинтеза ряда белков,действительно, отличается. Эти белки были идентифицированы с помощью массспектрометрии, результаты также представлены на рис. 2.7. Функционально эти белки несвязаны, среди них есть и факторы транскрипции и трансляции, и белки теплового шока, иферменты метаболизма. Нам не удалось установить какой-либо общности у этих белков.Возможно, наблюдаемые здесь эффекты являются вторичными, ведь изменениеколичества одних белков может сказываться на количестве других. Для устранения этихвторичных эффектов мы решили сравнить текущий синтез белка в клетках дикого типа и∆rimK на разных фазах роста.55Рисунок 2.7.
Двумерный электрофорез суммарного белка из клеток дикого типа и ∆rimK вразличныз фазах роста. Горизонтальное направление – изоэлектрофокусировка,вертикальное – распределение белков по массе. Белки из клеток дикого типа окрашенызелёной краской Cy3, а из клеток ∆rimK – красной Cy5.Мы использовали пульс-мечение вновь синтезированных белков с помощьюгомопропаргилглицина. Последний, выступая в качестве аналога метионина, способенсвязыватьсясметиониновойаминоацил-тРНКсинтетазой,присоединятьсякметиониновой тРНК и таким образом встраиваться во вновь синтезированные белки.Белки, содержащие остаток гомопропаргилглицина могут быть помечены флуоресцентнойкраской Cy5 или Cy3, содержащей азидную группу (так называемая реакция клик-химии,рис. 2.8). С помощью такого подхода можно пометить белки, которые синтезированыпосле добавления гомопропаргилглицина к среде, то есть зафиксировать текущий синтезбелка [83].56Рисунок 2.8.
Схема эксперимента пульс-мечения вновь синтезированных белков спомощью гомопропаргилглицина.Таким образом, мы сравнили текущий синтез белка в клетках дикого типа и ∆rimKв разных фазах роста (рис. 2.9). В клетках из стационарной фазы роста, когда белок S6модифицирован (в клетках дикого типа), разница между диким типом и ∆rimK оказаласьдраматической.
Уровень биосинтеза белка в клетках, в которых белок S6 модифицирован,значительно ниже, чем в клетках, где модификации не происходит.Рисунок 2.9. Двумерный электрофорез вновь синтезированного белка из клеток дикоготипаи∆rimKвразличнызфазахроста.Горизонтальноенаправление–изоэлектрофокусировка, вертикальное – распределение белков по массе. Белки из клетокдикого типа окрашены зелёной краской Cy3, а из клеток ∆rimK – красной Cy5.57Для детекции столь сильного эффекта, использование дифференциальногодвумерного электрофореза стало излишним. Чтобы увидеть, что происходит с уровнембиосинтеза белка в клетках в стационарной фазе и во время перехода в логарифмическуюфазу, достаточно одномерного денатурирующего ПААГ. Мы переносили культуры дикоготипа и ∆rimK в стационарной фазе в свежую среду и добавляли к средегомопропаргилглицин через фиксированные промежутки времени, метили вновьсинтезированные белки флуоресцентной краской Cy5 и сравнивали встраивание метки(рис.
2.10).Рисунок 2.10. Синтез белка in vivo в клетках дикого типа и ∆rimK. (1) Клетки встационарной фазе. (2, 3, 4) Клетки через 0,5; 1 и 2 часа после разбавления свежейсредой, соответственно. Верхний гель – встраивание HPG во вновь синтезируемыйбелок. Нижний – тот же гель, покрашенный Кумасси.58Оказалось, что в логарифмической фазе роста, когда белок S6 не модифицирован, ирибосомы в обоих типах клеток не различаются, заметной разницы в текущем синтезебелка нет. В стационарной же фазе синтез белка в клетках дикого типа, в которых белокS6 модифицирован, значительно ниже, чем в клетках ∆rimK. Во время выхода клетокдикого типа из стационарной фазы происходит замещение модифицированного белка S6вновь синтезированным немодифицированным S6.
При этом разница в текущем синтезебелка в клетках дикого типа и ∆rimK постепенно нивелируется. Это позволяетпредположить,чтоолигоглутамилированиебелкаS6приводиткснижениютрансляционной активности рибосом. В логарифмической фазе роста, когда нетнедостатка в питательных веществах, в клетках идёт активный синтез белка. Встационарной фазе роста, в условиях голода, клетке необходимо экономить свои ресурсы.Для этого, прежде всего, необходимо свести к минимуму синтез белка, одного из самыхэнергозатратных процессов в клетке. Олигоглутамилирование белка S6 выключает синтезбелка в клетке в стационарной фазе роста.592.4. Влияние модификации белка S6 на активность рибосом in vitroДействительно ли рибосомы, содержащие олигоглутамилированный белок S6,менее эффективно синтезируют белок? Достаточно ли модификации белка S6 длявыключениятрансляционнойактивностирибосомы,илитребуютсякакие-тодополнительные факторы, связывающиеся с олигоглутамилированным S6? Для ответа наэти вопросы мы осуществили in vitro трансляцию рибосомами, выделенными из клетокдикого типа и ∆rimK из логарифмическойистационарнойэффективностислужилафазinроста.vitroактивностьМеройтрансляцииinvitroсинтезированной люциферазы светлячка.Изрезультатов,рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
