Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6 (1105555), страница 7
Текст из файла (страница 7)
1.25). Мономер RimK имеет массу 35 кДа исостоит из 300 аминокислотных остатков. Он обладает продолговатой формой, состоит изтрёх структурных доменов и имеет классическую АТФ-связывающую укладку.Сердцевина N-концевого домена А (остатки 1-99) состоит из четырёх параллельныхскрученных β-тяжей, зажатых между двумя α-спиралями с каждой стороны; наповерхности домена А находится трёхтяжевой β-лист, направленный перпендикулярно по42Рис. 1.25. Структура мономера RimK. Структурные элементы показаны разнымицветами: синим показан домен A, зелёным – домен B, жёлтым – домен C, красным –последняя C-концевая спираль, голубым – соединения между доменами, розовым – трипетли активного центра: АТФ-связывающая, малая и центральная.
АДФ показана впространственной модели, а остальные лиганды, сульфат- и глутамат-ионы, показаныпалочками [82].отношению к находящемуся в сердцевине домена β-листу. Центральный домен B (остатки116-183) состоит из четырёх антипараллельных β-тяжей, с одного бока от которыхнаходятся две противоположно направленные α-спирали. Домены A и B соединеныдлинным линкером (остатки 100-115), представляющим собой α-спираль. C-концевойдомен C (остатки 184-275) состоит из пяти антипараллельных β-тяжей, с двух сторон откоторых находятся две α-спирали, направленные перпендикулярно по отношению к βтяжам.
Оставшиеся аминокислотные остатки приходятся на С-концевую α-спираль,приближенную к N-концу. В щели между доменами B и C находится место посадки АТФ,расположенноемеждудвумяантипараллельнымисвязывающей петлёй43β-листамиискрытоеATФ-Рис. 1.26. Структура активного центра RimK. Белок показан как серая ленточнаядиаграмма с тремя красными петлями активного центра: АТФ-связывающей, малой ицентральной. Связанная молекула АДФ показана голубыми палочками, а моделированныйполи-α-глутамат, Glu4, – розовыми.
Остатки, консервативные для белков RimK, LysX иглутатион-синтетазы, показаны зелёными палочками. Вариабельные остатки, которыемогут играть важную роль в связывании Glu4, показаны жёлтыми палочками [82].Активный центр фермента (рис. 1.26) находится в пределах впадины, образуемойтремя доменами, и включает в себя следующие аминокислотные остатки: Lys100, Asp187,Arg189, Arg203, Asn213, Asp248, Glu260 и Asn262. По всей видимости, именно этиостатки,являющиесяконсервативнымидлявсехизвестныхпредставителейсуперсемейства АТФ-связывающих ферментов (в частности, LysX, участвующий вбиосинтезе лизина, и глутатион-синтетазы), играют ключевую роль в связываниисубстрата и процессе катализа.Белок RimK также может формировать тетрамер (рис.
27), являющийся димеромдимеров с двумя интерфейсами. В первом, протяжённом димерном интерфейсе тяж B1’ наповерхности домена А одной молекулы образует водородные связи тяжем B5 домена Bдругой молекулы и наоборот, а также спирали H2 и H4 в первой молекуле параллельновзаимодействуют cо смежными спиралями H4 и H2 второй молекулы. Второй, малыйдимерный интерфейс включает в себя взаимодействие спирали H6 и тяжа B7 одноймолекулы с тяжем B7 и спиралью H6 другой молекулы соответственно.
Отмечается, чтотетрамер стабилен в растворе вне зависимости от присутствия АТФ, что подтверждаетсярезультатом гель-фильтрационного анализа [82].44Рис. 1.27. Структура тетрамера RimK. Разные мономерные субчастицы показаныкрасным, жёлтым, синим и зелёным соответственно. Связанные молекулы АДФпоказаны в пространственных моделях [82].Белок S6 располагается в центральном домене малой субчастицы рибосомы(рис.
1.28) Взаимодействуя с белками S18, S8 и S15, он предохраняет 16S рРНК от атакиэндонуклеаз. С-концевые аминокислотные остатки S6 выступают наружу и не видны вкрасталлической структуре.S6 – самый кислый белок 30S-субчастицы (pI = 4,8), а наблюдаемаяпосттрансляционная модификация дополнительно усиливает его кислотность. Функцияэтой модификации не выяснена, кроме того, это первый установленный случайпосттрансляционного добавления аминокислотных остатков.45Рисунок 1.28. Расположение S6 на малой субчастице. Серым показана рРНК, зелёным –белки, оттенками жёлтого – тРНК, фиолетовым – мРНК, циановым – EF-Tu, синим –белок S6, красными сферами – С-концевой остаток.46ЗаключениеФерментативные модификации рибосомных белков прокариот хорошо описаны.Тем не менее, функциональная роль таких модификаций остаётся непонятной.Установлено, что некоторые модификации рибосомной РНК требуются для правильнойсборки рибосом, взаимодействия с рибосомными лигандами, формирования устойчивостик антибиотикам.Среди посттрансляционных модификаций белков Escherichia coli одна из самыхнеобычных у рибосомного белка S6.
К его С-концу добавляются дополнительные остаткиглутаминовой кислоты. Модификацию осуществляет специальный фермент RimK. Этопервый установленный случай такого последовательного наращивания полипептиднойцепи. Зачем эта модификация нужна, и почему дополнительные остатки добавляютсяпосттрансляционно (ведь их можно закодировать в геноме) – до сих пор не установлено.Известно, что эта модификация, как и все остальные модификации рибосомных белков, неявляется жизненно необходимой для клетки.
Штамм с нокаутом гена rimK жизнеспособен.Белок S6 – самый кислый белок бактериальной рибосомы (pI немодифицированнойформы 5,26). Наблюдаемая посттрансляционная модификация дополнительно усиливаетего кислотность (pI полностью модифицированной формы 4,93). Белок S6 располагается врегуляторной области малой субчастицы рядом с местом посадки мРНК и тРНК в Eучастке. Это косвенно может свидетельствовать о регуляторной роли модификации,осуществляемой ферментом RimK.Целью данной работы было понять функциональную роль посттрансляционноймодификации рибосомного белка S6 Escherichia coli.472. Обсуждение результатовВведениеВ поставленной задаче можно выделить три направления. Во-первых, необходимоустановить, когда происходит модификация, зависит ли она от внешних факторов илиявляется конститутивной.
Во-вторых, нужно понять, как происходит модификация, чтоявляется субстратом фермента RimK, это может быть свободный белок S6 или S6 всоставе различных рибосомных частиц. И, наконец, в-третьих, требуется выяснить, на чтовлияет модификация белка S6.В качестве объекта для изучения мы использовали штамм JW0836, в которомудалён ген rimK, а значит, отсутствует модификация белка S6. Во всех экспериментах мысравнивали этот штамм с родительским штаммом BW25113 (дикий тип). Кроме того намибыл получен штамм, в котором дополнительные остатки глутаминовой кислоты ужезакодированы в геномной ДНК. Для этого в геномную ДНК клеток из штамма ∆rimKвместо гена rpsF, кодирующего рибосомный белок S6, была вставлена кассета, состоящаяиз гена rpsF, уже кодирующего дополнительные 4 остатка глутаминовой кислоты на Сконце, и гена устойчивости к хлорамфениколу (рис.
2.1). Для контроля была вставленатакая же кассета, но без дополнительных остатков глутамата. Таким образом, был полученмодельный штамм, в котором модификация белка S6 всегда присутствует - ∆rimK-S6-E4cat (либо всегда отсутствует в случае контрольного штамма ∆rimK-S6-cat).Рисунок 2.1. Используемые в работе штаммы E. coli. В штамме ∆rimK модификациябелка S6 отсутвует. В штамме ∆rimK-S6-E4-cat 4 дополнительных остаткаглутаминовой кислоты внесены в ген rpsF, штамм ∆rimK-S6-cat – контрольный.48Способ получения модельных штаммов подробно описан в разделе «Материалы иметоды». Штаммы были проверены с помощью ПЦР с геномной ДНК с праймерами S6ver-f и S6-ver-r, которые комплементарны участкам ДНК, фланкирующим ген rpsF.
Есливставка произошла, то в результате должен получиться более длинный продукт, чем вслучае исходного штамма.Рисунок 2.2. Анализ модельных штаммов на предмет наличия вставок S6-E4-cat и S6-catс помощью ПЦР с геномной ДНК. 1 – ДНК из исходного штамма (без вставки); 2 - ДНКиз штамма ∆rimK-S6-cat; 3 – ДНК из штамма ∆rimK-S6-E4-cat.На рис. 2.2 показаны результаты проверки. Видно, что в обоих случаях вставкакассеты в геномную ДНК произошла. Полученные ПЦР-продукты были секвенированы.
Врезультате было показано, что в полученных штаммах ген rpsF, действительно кодируеттребуемое количество остатков глутаминовой кислоты на С-конце белка S6, а также, чтоген не садержит никаких дополнительных мутаций (рис. 2.3).49Рисунок 2.3. Результат секвенирования гена rpsF в штаммах ∆rimK-S6-cat и∆rimK-S6-E4-cat.502.1.
Зависимость модификации белка S6 от стадии роста бактериальнойкультурыПервый вопрос, на который мы хотели получить ответ, когда происходитмодификация белка S6, зависит ли она от внешних факторов или являетсяконститутивной. Мы выяснили это, проанализировав наличие модификации белка S6 наразных стадиях роста бактериальной культуры.Добавление дополнительных аминокислотных остатков к белку S6 приводит кувеличениюегомолекулярноймассы,чтоуменьшаетподвижностьбелкавденатурирующем полиакриламидном геле. Это позволяет отличить модифицированнуюформубелкаS6отнемодифицированнойспомощьюиммуноблоттингасоспецифическими антителами на S6.
Используя этот подход, мы проанализировалиолигоглутамилирование белка S6 на разных стадиях роста бактериальной культуры E. coliдикого типа (рис. 2.4). Оказалось, что модификация S6 наблюдается только встационарной фазе роста и отсутствует в логарифмической. В аналогичном контрольномэксперименте с культурой клеток штамма ∆rimK, модификация белка S6 отсутствует вовсех фазах роста.Рисунок 2.4. Анализ модификации белка S6 на разных стадиях цикла роста культуры спомощью иммуноблоттинга с антителами на S6. Дорожки соответствуют образцамсуммарных белков клеток, взятых через указанное время после разбавления в свежей средекультуры в стационарной фазе.При переходе бактериальной культуры из стационарной фазы в логарифмическуюмодификация S6 в клетках пропадает.
Возможны два альтернативных механизма, которыеобъяснили бы утрату модификации. Модифицированный белок S6 может замещатьсябольшимколичествомвновьсинтезированногонемодифицированногоS6,либосуществует специальный механизм активной демодификации S6 во время выходакультуры из стационарной фазы роста. Чтобы установить, какой из этих механизмовреализуется, мы проанализировали статус модификации S6 на разных стадиях роста51культуры штамма ∆rimK-S6-E4-cat, в котором дополнительные остатки глутаминовойкислоты закодированы в геномной ДНК, а также в контрольном штамме ∆rimK-S6-cat.Результаты представлены на рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
