Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6 (1105555), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Приготовление клеточного экстракта S30 ..................................................973.2.5.11. In vitro трансляция ...........................................................................................983.2.5.12. Проведение модификации белка S6 in vitro....................................................984. Выводы ....................................................................................................................................99Список литературы.................................................................................................................1004Список принятых сокращенийДНК – дезоксирибонуклеиновая кислотаРНК – рибонуклеиновая кислотарРНК – рибосомная РНКмРНК – матричная РНКтРНК – транспортная РНК50S – большая субчастица рибосомы30S – малая субчастица рибосомыS1-S21 – белки малой субчастицы рибосомыL1-L36 – белки большой субчастицы рибосомыIF2 – инициаторный фактор 2EF-Tu – элонгационный фактор TuEF-G – элонгационный фактор GRF3 – фактор терминации 3SAM – S-аденозилметионинДа, кДа – дальтон, килодальтонДМСО – диметилсульфоксидSDS – додецилсульфат натрияHPG - гомопропаргилглицинБСА – бычий сывороточный альбуминDTT – 1,4-дитиотреитолИПТГ – изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозидПААГ – полиакриламидный гельТЕМЕD – N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамидЭДТА – этилендиаминтетраацетат натрияHEPES – N-2-гидроксиэтилпиперазин-N′-2-этансульфоновая кислотаTris –трис(гидроксиметил)аминометанАТФ – аденозин-5′-трифосфатАДФ- аденозин-5′-дифосфатГТФ – гуанозин-5′-трифосфатЦТФ – цитидин-5′-трифосфатУТФ – уридин-5′-трифосфатУФ – ультрафиолетE.
coli – Escherichia coli5ВведениеБиосинтез белка – один из ключевых процессов в живых организмах. Генетическаяинформация хранится и передаётся в виде последовательности нуклеотидов ДНК. Длятого чтобы перевести её в последовательность аминокислот, в живой клетке существуетспециальная структура – рибосома, представляющая собой сложный комплекс белков ирРНК. Главная задача рибосомы – обеспечить узнавание кодона мРНК молекулой тРНК,несущей нужную аминокислоту, и ориентировать в пространстве две молекулы тРНКтаким образом, чтобы между присоединёнными к ним аминокислотными остаткамиобразовалась пептидная связь.Трансляция является одним из самых энергозатратных процессов в клетке. Этозначит, что клетка нуждается в очень хорошо налаженной системе регуляции работырибосомы в соответствии с потребностью в тех или иных белках. В естественной средеобитания бактериальная клетка большую часть времени проводит в условиях недостаткаресурсов.
Это значит, что необходима система эффективного «выключения» рибосомы, впротивном случае, клетка будет тратить свои энергетические резервы, что неизбежноприведет к их исчерпанию. С другой стороны, в случае появления во внешней средепитательных веществ, клетке нужно обратно «включить» рибосому, чтобы расти иделиться. Бактерии используют целый ряд механизмов для обратимого подавлениятрансляции в неблагоприятныхусловиях. Важность изучения этих механизмовподкрепляется их терапевтической значимостью, ведь именно они позволяют патогенампережить воздействие антибиотиков.В 2009 году за изучение структуры и функции рибосомы была присужденаНобелевская премия по химии.
Её лауреаты получили кристаллы рибосом и провелирентгеноструктурный анализ. Это позволило узнать структуру рибосомы с точностью доатома. Тем не менее, до сих пор остаются загадками многие аспекты работытрансляционного аппарата. Одна из таких загадок – ферментативные модификациикомпонентоврибосомы,такиекакметилирование,псевдоуридинилирование,дигидроуридинилирование рРНК а также метилирование, ацетилирование рибосомныхбелков. Хотя эти модификации не являются жизненно необходимыми для клетки, но длямногих из них предполагается регуляторная роль.Помимо вышеописанных модификаций компонентов рибосомы существуют иболее специфические.
Рибосомный белок S6 E. coli подвергаетсяпосттрансляционноймодификации.СпециальныйферментRimKуникальнойприсоединяетдополнительные остатки глутаминовой кислоты к его С-концу. Данная работа посвящена6изучению функциональной роли олигоглутамилирования рибосомного белка S6. Былавыяснена регуляция этой модификации, субстратная специфичность фермента RimK, атакже установлена роль данной посттрансляционной модификации в подавлениитрансляции в неблагоприятных условиях.71.
Обзор литературы.Посттрансляционные модификации рибосомных белков Escherichia coliВведениеРибосома – сложная молекулярная машина, отвечающая за правильный переводгенетической информации с последовательности нуклеотидов мРНК в последовательностьаминокислот синтезируемого белка.
Она представляет собой комплекс рибосомных РНК ибелков, который состоит из двух неравных частей (большой и малой субчастиц). В E. coliмалая субчастица состоит из 16S рРНК и 21 белка (обозначаемых S1-S21), а большая – из5S и 23S рРНК и 33 различных белков (L1-L36). Как рРНК, так и рибосомные белкиподвержены ферментативной модификации в клетке (табл. 1). Больше половинырибосомныхбелковподвергаютсяотщеплениюN-концевогометионина.Шестьрибосомных белков метилированы (S11, L3, L11, L12, L16, L33), три – ацетилированы (S5,S18 и L7), один метилтиолирован (S12), один гидроксилирован (L16), к одномудобавляютсядополнительныеаминокислотныеостатки(S6),одинподвергаетсячастичному протеолизу (L31). Природа некоторых модификаций рибосомных белков E.coli до сих пор не установлена [1].В большинстве случаев идентифицированы гены, которые кодируют ферменты,осуществляющие ту или иную модификацию.
Как правило, мутации в этих генах нелетальны для клетки, но зачастую ведут к небольшим фенотипическим отличиям отдикого типа (скорость роста, чувствительность к стрессовым условиям). Это говорит орегуляторной роли, которую выполняют посттрансляционные модификации.В обзоре литературы мы постарались собрать всю имеющуюся на сегодняшнийдень информацию о посттрансляционных модификациях рибосомных белков E. coli и оферментах, осуществляющих эти модификации.8Таблица 1. Посттрансляционные модификации рибосомных белков E.
coliБелокПоложение модификацииМодификацияS5N-концевая аминогруппаАцетилированиеМодифицирующийферментRimJДобавление дополнительныхS6C-конецостатков глутаминовойRimKкислотыN-концевая аминогруппаS11Метилирование, образованиеизопептидной связи.Образование остаткаизоаспартатаНе установленНе установленS12Asp88МетилтиолированиеRimOS18N-концевая аминогруппаАцетилированиеRimIL3Gln150МетилированиеPrmBL7/L12Lys81МетилированиеНе установленL11Ala1, Lys3, Lys39МетилированиеPrmAL12N-концевая аминогруппаАцетилированиеRimLL16N-концевая аминогруппаМетилированиеНе установленL16Arg81ГидроксилированиеYcfDL31С-конецL33N-концевая аминогруппаУдаление аминокислотныхостатковМетилирование9Не установленНе установлен1.1.
Процессинг N-конца рибосомных белковСамый распространённый тип посттрансляционной модификации белков –удаление N-концевого остатка метионина, осуществляемое ферментом метионинаминопептидазой (MAP). В случае рибосомных белков E. coli оно наблюдается в34 случаях из 56 (данные представлены в табл. 2).Эта модификация наиболее часто встречается в том случае, когда следующий заметионином аминокислотный остаток имеет короткую боковую цепь [2].
Большие поразмеру боковые цепи в этом случае препятствуют попаданию белка в активный центрметионин аминопептидазы. Когда вторым аминокислотным остатком является аланин(21 случай), метионин всегда удалён. Аналогично в случае лейцина, пролина и глицина вположении 2. Если же за первым остатком следует лизин, изолейцин, глутамин, аргинин,аспарагиновая кислота, тирозин, глутаминовая кислота, фенилаланин или валин(20 случаев), то метионин всегда сохраняется.
Когда серин находится в положении 2, вчетырёх случаях из пяти метионин сохраняется. В случае белка L33 удаление остаткаметионина осуществляется только для некоторой доли белковых молекул, часть цепей (неболее 25%) остаётся с N-концевым метилированным метионином. Вероятно, это связано сконкуренцией N-концевого метилирования и отщепления метионина [3].Таблица 2. Посттрансляционное удаление N-концевого остатка метионина в рибосомныхбелках E. coli [1].Удаление2-й остатокS13+AlaMetпосле MetS14+AlaS1?ThrS15+SerS2+AlaS16–ValS3+GlyS17+ThrS4+AlaS18+AlaS5+AlaS19+ProS6–ArgS20+AlaS7+ProS21+ProS8+SerS22–LysS9+AlaL1+AlaS10–GlnL2+AlaS11+AlaL3–IleS12+AlaL4–GluL5+AlaБелок10L6+SerL23–IleL7+SerL24+AlaL9–GlnL25–PheL10+AlaL26+AlaL11+AlaL27+AlaL12+SerL28+SerL13–LysL29–LysL14–IleL30+AlaL15–ArgL31–LysL16–LeyL32+AlaL17–ArgL33+AlaL18–AspL34–LysL19–SerL35+ProL20+AlaL36–LysL21–TyrL22–Glu111.2.
Процессинг С-конца белка L31Определённая химическим путём последовательность С-конца рибосомного белкаL31 (…RFNK) [4] отличается от предсказанной из последовательности гена L31(…RFNKRFNIPGSK). Был сделан вывод, что белок L31 подвергается процессингу Сконца (возможно, существует специфическая протеаза, удаляющая фрагмент RFNIPGSK).В последующей работе эти данные были опровергнуты, полученная последовательностьостатков L31 согласуется с геномом [5]. Однако масс-спектрометрический анализрибосомных белков показывает наличие двух пиков для L31: при 7871,1 Да, которыйсоответствует полной последовательности L31, предсказанной из генома, и при 6971,1 Да,соответствующий фрагменту L31 без С-концевого участка …RFNIPGSK [1].
Повидимому, процессинг белка L31 происходит частично.Рисунок 1.1. Расположение L31 на большой субчастице. Серым показана рРНК, зелёным– белки, синим – белок L31, красным – C-концевой остаток.L31 – малоизученный компонент бактеральной рибосомы. Известно, что онобразует рибонуклеопротеидный комплекс с белками L5, L18, L25 и 5S рРНК, а также, чтоон располагается на вершине центрального протуберанца (рис. 1.1) в непосредственнойблизости с местом контакта субчастиц. Посттрансляционная модификация, возможно,служит для активации белка, либо играет регуляторную роль.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
