Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6 (1105555), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Этиданные свидетельствуют, что ацетилирование S5 осуществляется на собранной рибосоме.Функция RimJ связана не только с модификацией белка S5, но и с другими этапамибиогенеза малой субчастицы рибосомы [41]. В штамме E. coli, в котором содержитсямутация в гене белка S5 (28-й остаток глицина заменён на аланин), нарушена сборкарибосомы и снижена точность трансляции, также наблюдается чувствительность кхолоду. Суперэкспрессия RimJ в этом штамме полностью восстанавливает все дефектытрансляции.
Это означает, что RimJ не зависимо от ацетилтрансферазной активностивносит вклад в формирование правильной структуры рибосомы. Доказательством можетслужить то, что RimJ связывается с 30S субчастицей на ранних стадиях её сборки [41].Функции RimJ как фактора сборки рибосомы и ацетилтрансферазы могут бытьсовмещены, и осуществляться одновременно или последовательно.27БелокрасполагаетсяS5противоположнойпоотношениюнакдекодирующему центру стороне малойсубчастицы(рис. 1.11).N-концевыеостатки выступают над поверхностьюрибосомы и не видны в кристаллическойструктуре.
Значит, α-аминогруппа первогоостатка S5 в составе рибосомы доступнадля ацетилирования, что согласуется срезультатами из работы [39].У белка RimJ найдены функции, несвязанные напрямую с ацетилированиемS5.Показано,чтоRimJявляетсярепрессором pap оперона, отвечающего забиосинтезпилейвпатогенномпиелонефрическом штамме E. coli. RimJрегулирует транскрипцию этого оперона вРисунок 1.11.
Расположение S5 на малойзависимостисубчастице.отвнешнихСерымпоказанарРНК,питательныхзелёным – белки, оттенками жёлтого –которомутРНК, фиолетовым – мРНК, циановым –происходит эта регуляция и связь её сEF-Tu, синим – белок S5, красными сферамиацетилтрансферазной функцией RimJ не– N-концевой остаток.(температура,веществ).наличиеусловийМеханизм,поустановлены [42].281.4.2.
Ацетилирование белка S18Белок S18, как и S5 и L12, подвергается аминоконцевому ацетилированию (поостатку аланина) [43]. Модификация осуществляется специфической ацетилтрансферазойRimI[38].Модификация не является необходимой для клетки, мутанты по гену rimI не толькожизнеспособны, но и не проявляют никаких фенотипических отличий от дикого типа,кроме отсутствия модификации S18 [44].ОпределенапространственнаяструктураRimIизSalmonellatyphimurium(первичная структура полностью идентична RimI из E.
coli) [33]. Фермент имеетсмешанную αβ структуру с центральным семитяжевым β-листом, фланкированнымчетырьмяα-спиралями(рис. 1.12).Центральныйβ-листимеетпреимущественноантипараллельную структуру, за исключением тяжей 4 и 5, которые параллельны.Порядок β-тяжей в листе линейный, кроме тяжа β7, расположенного между β5 и β6. Листимеет V-образную структуру, в которой тяжи β1-β4 формируют одно плечо, а β5-β7 –другое.
Предполагается, что в V-образном расширении между β4 и β5-тяжамирасполагается ацетилтрансферазный центр.Рисунок 1.12. Структура RimI. Фермент изображён в виде лент, субстрат икофермент в каркасном виде. Элементы вторичной структуры окрашены зёлёным,жёлтым, красным и синим в порядке их следования с N-конца [33].29Исходя из данных по пространственной структуре комплекса фермента ссубстратомикоферментом(ацетилкоферментомA)былпредложенмеханизмацетилтрансферазной реакции (рис. 1.13).N-концевой атом азота S18 нуклеофильно атакует карбонильный атом углеродаацетилкофермента A, остаток Glu103 выступает здесь как акцептор протона (рис.
13, i).Это приводит к образованию тетраэдрического интермедиата (рис. 13, ii), которыйраспадается на продукты, при этом остаток Tyr115 служит донором протона (рис. 13, iii).Рисунок 1.13. Предполагаемый механизм реакции, катализируемой ферментом RimI. а –нуклеофильная атака карбонильного атома ацетилкофермента А; б – образованиететраэдрического интермедиата; в – комплекс RimI с продуктами[33].Несмотря на то, что установлен механизм ацетилирования S18, до сих пор остаётсяневыясненным, в чём его функция, и когда оно происходит. Белок S18 располагается вцентральном домене малой субчастицы рибосомы рядом с белками S11 и S6, причёмвзаимодействие S18 c S6 настолько прочно, что образуется стабильный гетеродимер [45].S18 находится вблизи Е-участка (рис.
1.14) Первые 15 аминоконцевых остаткааминокислот S18 не видны в кристаллической структуре рибосомы, а значит, скореевсего,неимеютфиксированногоположениявпространстве.Возможно,онирасполагаются рядом с участком посадки мРНК на малую субчастицу (рис. 1.14), в этомслучае, N-концевое ацетилирование может оказывать влияние на процесс инициациитрансляции.30Рисунок 1.14. Расположение S18 на малой субчастице.
Серым показана рРНК, зелёным –белки, оттенками жёлтого – тРНК, фиолетовым – мРНК, циановым – EF-Tu, синим –белок S18, красными сферами – N-концевой остаток.311.4.3. Ацетилирование белка L12Рибосомный белок L12 существует в двух различных формах: не ацетилированной(L12) и ацетилированной (называемой L7) [46]. Из-за такой близости в структурах влитературе этот белок называют L7/L12.Ацетилирование α-атома азота первого остатка серина L12 с образованием L7осуществляется специфическим ферментом RimL [48]. RimL может ацетилировать in vitroкак свободный белок L12 [49], так и L12 в составе рибосомы [34].
По-видимому, in vivoмодификация L12 тоже может идти на любом этапе биогенеза рибосомы. В отличие от S5и S18, которые модифицированы полностью, L12 ацетилирован лишь частично.Соотношение L7/L12 варьирует взависимости от фазы и скоростироста. В середине логарифмическойфазы доля L12 достигает 85%, затемсодержаниепостепенноL7увеличивается и становится 75-80% встационарной фазе [50]. При ростеклеток в минимальной среде белокцеликом переходит в форму L7.Показано, что модификацияL12 повышает прочность комплексатетрамера L7/L12 с белком L10 [47].Авторы объясняют этоацетилированиетем,чтостабилизируетN-концевые α-спирали L7 (на рис. 1.15обозначены α1), фиксируя положениеаминоконцевогопространстве,остаткаитемвсамымкомпактизуя структуру, делает еёболее прочной.Темнеменее,штаммсРисунок 1.15.
50S субчастица рибосомы E. coli имутацией в гене rimL, в котором весьвходящий в её состав комплекс L7/L12 и L10белок[47].L12присутствуетвдеацетилированной форме, не имеет никаких заметных фенотипических отличий отдикого типа, в частности, нет разницы в скорости роста при 25, 37 и 42ºС [49]. Значит,32модификация не является важной для функционирования рибосомы, а вопрос о еёвозможной функции до сих пор остаётся открытым.Установлена субстратная специфичность RimL [34].
Первый изучаемый аспекткасалсяприродыN-концевогоаминокислотногоостаткасубстрата.Согласнолитературным данным, в Nα-ацетилированных белках это, как правило, серин, аланин илиметионин. Например, в L12 из E. coli это серин, а в L12 из Pseudomonas aeruginosa иBacillus subtilis – аланин. В S18 и S5 – также аланин. Было сделано предположение, чтоRimL не проявляет специфичности к аминоконцевому остатку. Это было подтвержденоэкспериментально, RimL эффективно ацетилирует in vitro мутантный L12, в котором Ser1заменён на Ala1 [34].ВторойаминокислотныйостатокNα-ацетилируемогобелкавлияетнамодификацию первого в случае эукариотических Nα-ацетилтрансфераз. Если второйостаток – аспартат или глутамат – то модификация идёт эффективно. Чтобы исследоватьэффект второго аминокислотного остатка на активность RimL был получен мутантныйL12, в котором Ile2 заменён на Asp2.
Оказалось, что RimL ацетилирует такой мутантныйбелок гораздо менее эффективно, чем нативный L12. Это ещё раз подчёркивает отличиемежду прокариотическими и эукариотическими Nα-ацетилтрансферазами [34].Получена кристаллическая структура RimL из Salmonella typhimurium.
RimLпредставляет собой гомодимер, способный связать 2 молекулы ацетилкофермента A имодифицировать димерный L12 [51].Помимо ацетилирования L12 RimL обеспечивает защиту клетки от воздействияряда антибиотиков. Установлено, что RimK ацетилирует микроцин C (McC), делая егонетоксичным для клетки, таким образом, клетки, содержащие активный RimL,оказываются устойчивыми к этому антибиотику. Кроме того, суперэкспрессия RimLделает клетки устойчивыми к альбомицину и ряду синтетических негидролизуемыханалогов аминоациладенилатов – аминоацилсульфомаиладенилатам (аспартил-, лейцил-,лизил-, глицил-, аланил- и фенилаланилсульфомаиладенилату), которые также становятсянетоксичными вследствие ацетилирования.
У ферментов RimI и RimJ данной активностине наблюдается [52].331.5. Гидроксилирование белка L16В рибосомном белке L16 гидроксилирован β-атом углерода 81-го остатка аргинина.Модификацияосуществляетсяспецифическим ферментом YcfD(RoxA),членомсемейства 2-оксогутарат/Fe2+-зависимых оксигеназ. В результате гидроксилированияобразуется дополнительный хиральный центр, модифицированный остаток аргининаимеет конфигурацию 2S, 3R [53].Модификация не является жизненно необходимой для клетки, штамм ∆ycfDжизнеспособен, но при этом в бедной среде рост нокаутных клеток заметно ниже, чемклеток дикого типа.
Кроме того суммарная активность трансляционного аппарата вклетках ∆ycfD в 3-4 раза ниже, чем в клетках дикого типа [53].Установлена пространственная структура YcfD (рис. 1.16). Каталитический Nконцевой домен представляет собой DBSH-домен (double stranded beta helix), что являетсяхарактерной чертой 2-оксогутарат/Fe2+-зависимых оксигеназ. Основу домена составляютдва β-листа, первый построен из пяти цепей, второй – из трёх, вместе они образуютструктуру β-бочки. Внутри этой бочки располагается каталитический центр, в которомнаходится ион Fe2+, координированный остатками His125, Glu127 и His187 и двумямолекулами волы.
Биоинформатически и с помощью мутагенеза установлено, что всвязывании 2-оксогутарата участвуют остатки Ser116 и Arg140 [54].Рисунок 1.16. Структура мономера YcfD. α-спирали показаны синим цветом, β-тяжи –зелёным. Активный центр показан в увеличенном виде [54].34Белок L16 важен в организации структуры аминоацил-тРНК связывающего сайта.Удаление L16 негативно сказывается на ряде аспектов работы рибосомы, в том числе насвязываниесубчастицдругсдругом[55],связываниеаминоацилтРНК[56],пептидилтрансферазной активности [57], гидролизе пеgтидил тРНК [58].Фермент YcfD структурно гомологичен человеческим белкам Mina53 и NO66,которые катализируют гидроксилирование L27a и L8, соответственно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
