Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6 (1105555)
Текст из файла
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТимени М.В. ЛОМОНОСОВАХимический факультетКафедра Химии природных соединенийНа правах рукописиНЕСТЕРЧУК МИХАИЛ ВАСИЛЬЕВИЧВЫКЛЮЧЕНИЕ СИНТЕЗА БЕЛКА В БАКТЕРИАЛЬНОЙКЛЕТКЕ С ПОМОЩЬЮ ОЛИГОГЛУТАМИЛИРОВАНИЯРИБОСОМНОГО БЕЛКА S6Диссертация на соискание учёной степеникандидата химических наукСпециальность 02.00.10 – биоорганическая химияНаучный руководитель:доктор химических наук,профессор Сергиев П.В.Москва 2014СодержаниеСписок принятых сокращений.................................................................................................5Введение ........................................................................................................................................61. Обзор литературы.
Посттрансляционные модификации рибосомных белковEscherichia coli ..............................................................................................................................8Введение .....................................................................................................................................81.1. Процессинг N-конца рибосомных белков......................................................................101.2. Процессинг С-конца белка L31 .......................................................................................121.3. Метилирование рибосомных белков ..............................................................................141.3.1.
Метилирование белка L11 ........................................................................................151.3.2. Метилирование белка L3 ..........................................................................................191.3.3. Метилирование белка S11 и образование изомерной пептидной связи ..............221.3.4. Метилирование белка L7/L12...................................................................................241.3.5.
Метилирование белков L16 и L33 ...........................................................................251.4. Ацетилирование рибосомных белков.............................................................................261.4.1. Ацетилирование белка S5.........................................................................................271.4.2. Ацетилирование белка S18.......................................................................................291.4.3. Ацетилирование белка L12.......................................................................................321.5. Гидроксилирование белка L16 ........................................................................................341.6.
Метилтиолирование белка S12 .......................................................................................361.7. Олигоглутамилирование белка S6 ..................................................................................42Заключение...............................................................................................................................472. Обсуждение результатов ......................................................................................................48Введение ...................................................................................................................................482.1.
Зависимость модификации белка S6 от стадии роста бактериальной культуры .......512.2. Определение субстратной специфичности фермента RimK........................................532.3. Влияние олигоглутамилирования белка S6 на процесс трансляции...........................552.4. Влияние модификации белка S6 на активность рибосом in vitro ................................602.5. Влияние модификации белка S6 на выживаемость бактериальной культуры вусловиях дефицита ресурсов ..................................................................................................662.6. Связь модификации белка S6 c образованием спящих бактериальных клеток .........69Заключение...............................................................................................................................7823.
Материалы и методы............................................................................................................813.1. Реактивы и биопрепараты................................................................................................813.1.1. Реактивы .....................................................................................................................813.1.2. Буферы и растворы....................................................................................................813.1.3. Штаммы и плазмиды.................................................................................................843.1.4. Олигонуклеотиды ......................................................................................................853.2.
Методики, использованные в работе..............................................................................863.2.1. Манипуляции с ДНК .................................................................................................863.2.1.1. Выделение плазмидной ДНК ..............................................................................863.2.1.2. Определение концентрации ДНК в растворе.
.................................................863.2.1.3. Рестриктный анализ плазмидной ДНК............................................................863.2.1.4 Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле ...............................................873.2.1.5.. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля ...........................................873.2.1.6. Приготовление вектора и вставки...................................................................873.2.1.7. Лигирование ........................................................................................................873.2.1.8.
ПЦР. .....................................................................................................................883.2.1.9. Мутагенез с помощью набора QuickChange (Stratagene)...............................883.2.1.10. Секвенирование плазмид и ПЦР-продуктов ..................................................893.2.1.11. Приготовление компетентных клеток .........................................................893.2.1.12. Трансформация компетентных клеток.........................................................893.2.2.
Получение модельных штаммов ∆rimK-S6-cat и ∆rimK-S6-E4-cat .......................903.2.2.1. Получение кассеты для трансформации.........................................................903.2.2.2. Внесение кассеты в геномную ДНК..................................................................903.2.2.1. Анализ полученных клонов .................................................................................913.2.3. Получение плазмиды для экспрессии гена rimK ....................................................913.2.4. Работа с клеточными культурами ................................................................................923.2.4.1.
Определение титра клеток ..............................................................................923.2.4.2. Измерение выживаемости клеток в стационарной фазе роста..................923.2.4.3. Измерение скорости вытеснения клеток ∆rimK клетками дикого типа присовместном культивировании........................................................................................923.2.4.4. Определение количества спящих клеток (ампициллиновый тест)...............923.2.4.5.
Определение количества спящих клеток c помощью проточнойцитометрии .....................................................................................................................933.2.5. Выделение рибосом, белков, клеточных экстрактов .............................................933.2.5.1. Выделение фракции рибосом.............................................................................9333.2.5.2. Выделение суммарного рибосомного белка .....................................................943.2.5.3. Белковый электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях......................943.2.5.4.
Иммуноблоттинг ...............................................................................................943.2.5.5. Двумерный дифференциальный гель-электрофорез .......................................953.2.5.6. Окрашивание белковых ПААГ серебром ..........................................................963.2.5.7.
Идентификация белковых зон в ПААГ .............................................................963.2.5.8. Мечение флуоресцентной меткой вновь синтезированных белков. .............963.2.5.9. Выделение рекомбинантного фермента RimK с помощью Ni-NTA агарозы...........................................................................................................................................973.2.5.10.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
