Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6 (1105555), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Однако данных о функциисайт-специфического протеолиза L31, как и о его возможном механизме, нет.12Интересной особенностью белка L31 также служит наличие в геноме E. coli двухгенов этого белка со сходной, но не идентичной последовательностью [6]. В белке L31,присутствующем в клетках в «обычных» лабораторных условиях культивирования,имеется мотив «цинковая лента».

В условиях недостатка ионов цинка с помощьютранскрипционного регулятора Zur активируется экспрессия другого варианта L31,лишенного «цинковой ленты». Это переключение, по-видимому, способствует более«экономному» использованию ионов цинка в клетке. Аналогичный механизм описан длярибосомного белка L36 [7].131.3. Метилирование рибосомных белковМетилирование – один из наиболее распространённых типов посттрансляционноймодификации белков. Множество самых различных прокариотических и эукариотическихбелков метилированы.

Метилирование рибосомных белков происходит во всехорганизмах. Оно осуществляется специальными ферментами (метилтрансферазами),которые используют S-аденозилметионин в качестве донора метильных групп. Выделяют5 классов метилтрансфераз, отличающихся структурой и субстратной специфичностью.Метилирование рибосомных белков, как правило, происходит по боковойаминогруппе лизина или аргинина, также часто встречается метилирование N-концевойаминогруппы. В E. coli метилированы шесть рибосомных белков (представлены в табл. 2)[8]. Для двух белков (L11 и L3) идентифицированы специфические метилтрансферазы(PrmA и PrmB, соответственно), найдены кодирующие их гены. Об остальныхмодификациях известно очень немного.Некоторыеметилированныерибосомныебелкииграютважнуюрольвфункционировании рибосомы: L7/L12 и L11 взаимодействуют с факторами трансляции,L3 участвует в сборке рибосомы.

Но, несмотря на то, что функции этих рибосомныхбелков в достаточной степени известны, биологическое значение их метилирования досих пор не выяснено. Мутации в генах, кодирующих соответствующие метилтрансферазы,не приводят к заметным фенотипическим изменениям.

Вероятно, метилированиерегулирует внутри- и межмолекулярные взаимодействия в белке или влияет на егосродство к РНК, и, таким образом, действует на различные клеточные процессы, такие какрегуляция трансляции, её точность, процессинг РНК и сборка рибосомы.141.3.1. Метилирование белка L11Наиболее сильно метилированный белок бактериального аппарата трансляции –рибосомный белок L11 [9]. Он содержит три метилированных по аминогруппе остатка: Nконцевой остаток аланина триметилирован по α-аминогруппе, 3-й и 39-й остатки лизинатриметилированы по ε-аминогруппам.

Таким образом, всего к белку посттрансляционноприсоединяется 9 метильных групп [10]. Метилирование осуществляется однимферментом, который называется PrmA (protein modification). Этот фермент был выделен иохарактеризован [11]. Установлено, что это белок массой 31 кДа, использующий вкачестведонораметильнойгруппыS-аденозилметионинипреимущественномодифицирующий свободный белок L11. Последнее указывает на то, что метилированиепредшествует встраиванию белка в рибосому [11].Получен мутантный штамм E.

coli, не содержащий метильных групп в белке L11. Спомощью него определили положение гена prmA, кодирующего соответствующуюметилтрансферазу [12].Фермент PrmA обладает необычной субстратной специфичностью, котораяпозволяет ему модифицировать несколько аминогрупп белка, находящихся на расстояниидруг от друга и имеющих различную природу (α- и ε-аминогруппы). Для этого ферментдолжен либо связываться с субстратом в нескольких разных ориентациях, либо длямножественноймодификациииспользоватьсистемугибкогосубстратногопозиционирования, позволяющую переориентировать субстрат относительно постоянногоучастка связывания. Строение PrmA и механизм его взаимодействия с субстратом былподробно изучен [13,14].Метилтрансфераза PrmA состоит из двух доменов, соединённых гибким линкером(рис.

2). Большой каталитический С-концевой домен является типичным примеромметилтрансфераз класса I. Семитяжевой β-лист фланкирован с обеих сторон α-спиралями.Небольшой дополнительный трёхтяжевой β-лист служит связующим звеном между Сконцевым доменом и линкерной междоменной α-спиралью. Малый N-концевой доменсостоит из четырёхтяжевого β-листа, фланкированного с одной стороны междоменнойлинкерной α-спиралью, с другой – N-концевой α-спиралью.

N-концевой домен уникалендля PrmA и способен распознавать и связывать белок L11 (рис. 1.2) [13]. С помощьюбиоинформатических методов установлено, что N-концевой домен PrmA по структуренапоминает V-домен фактора EF-G, который при связывании с рибосомой находится внепосредственной близости к белку L11 [15].15Рисунок 1.2.СтруктураPrmAв Рисунок 1.3. Наложение структур PrmA вкомплексе с N-концевым доменом L11 различных конформациях. Зелёным и серымпоказаны 2 конформации PrmA в свободном[13].состоянии, жёлтым – комплекс фермента икофермента,розовым–вкомплексессубстратом. Видна высокая подвижность Nконцевого домена [13].Поверхность связывания N-концевого домена PrmA с белком L11 частичноперекрывается с поверхностью связывания L11 c 23S рРНК. Поэтому PrmA модифицируетL11 только в свободном состоянии, до его встраивания в рибосому. Это подтверждаетранее полученные данные метилирования L11 in vitro [11].

Связывание N-концевогодомена PrmA c L11 высокоспецифично, стабилизировано множеством водородных связей,тогда как каталитический С-концевой домен сам по себе не обладает специфичностью, еговзаимодействиессубстратомстабилизированолишьлокальнымгидрофобнымвзаимодействием (боковая цепь модифицируемого остатка лизина попадает в активныйцентр через туннель, образованный гидрофобными аминокислотными остатками, которыевзаимодействуют с углеводородной цепью). За счёт гибкости междоменного линкеракаталитический домен может изменять своё положение относительно связанного с L11 Nконцевого домена и метилировать все доступные для него аминогруппы (рис.

1.3).16В структуре каталитического домена имеется специальный гидрофобный кармандля связывания S-аденозилметионина, этот карман является открытым, то есть, возможенобмен между S-аденозилгомоцистеином (продуктом реакции) и S-аденозилметиониномбез нарушения фермент-субстратного комплекса. В активном центре PrmA нет атомов,затрудняющих вращение метилированной аминогруппы, это позволяет однаждысвязавшемуся с субстратом ферменту сразу триметилировать его. Для осуществленияметилирования аминогруппы необходимо наличие в каталитическом центре основногоаминокислотного остатка, акцептирующего протон с атома азота. Роль такого остатка,очевидно, выполняет His104, находящийся в активном центре напротив участкасвязывания кофактора.Рисунок 1.4.

Расположение L11 на большой субчастице. Серым показана рРНК, зелёным– белки, жёлтым – тРНК в P-участке, фиолетовым – мРНК, циановым –синтезируемый пептид, синим – белок L11, красными сферами – метилированныеостатки, жёлтыми сферами – остатки в L11, мутации в которых приводят кустойчивости к тиострептону.Таким образом, метилирование, осуществляемое ферментом PrmA, являетсяредким примером одновременного специфического узнавания мишени и множественноймодификации субстрата за счёт разделения в пространстве участка связывания икаталитического центра, а так же их взаимной подвижности. Одна молекула17метилтрансферазы способна последовательно ввести 9 метильных групп в белок L11 бездиссоциации фермент-субстратного комплекса.Белок L11 – это консервативный компонент большой субчастицы бактериальнойрибосомы и активный участник взаимодействия рибосомы с факторами инициации,элонгации и терминации трансляции.

Он состоит из двух доменов, соединённых междусобойгибкимлинкером:С-концевой,связывающий23SРНКиN-концевой,взаимодействующий с трансляционными факторами [13]. Последний является мишеньюантибиотика тиострептона, который ингибирует связывание EF-G c рибосомой(устойчивость к тиострептону обеспечивается рядом мутаций в N-концевом домене белкаL11) [16] (рис. 1.4). Методом криоэлектронной микроскопии показан прямой контактмежду N-концевым доменом L11 и факторами EF-G [15] и EF-Tu [17].Все аминокислотные остатки, которые триметилируются PrmA, находятся в Nконцевом домене. Такое расположение модифицированных остатков рядом с местомконтакта с факторами трансляции может указывать на функциональную рольметилирования. Структура PrmA является консервативной у всех бактерий, что такжеможет свидетельствовать о его вкладе в функционирование L11.

Но, тем не менее,функция модификации, осуществляемой ферментом PrmA, до сих пор не установлена.Штамм с мутацией гена prmA не только жизнеспособен, но и не обладает никакимизаметными отличиями от дикого типа (одинаковая скорость роста, одинаковое поведениев стрессовых условиях) [18,19]. Это означает, что множественное метилирование L11 неявляется необходимым для нормального функционирования рибосомы. В то же время ономожет оказывать влияние на скорость и точность некоторых этапов работы рибосомы,таких как декодирование и транслокация. Такое влияние может быть зафиксированотолько с применением очень точного кинетического анализа in vitro либо введениемспецифических мутаций в белок L11 или другие компоненты аппарата трансляции in vivo[13].181.3.2. Метилирование белка L3К рибосомному белку L3 посттрансляционно добавляется одна метильная группа[20]. Метилирование происходит по амидной группе 150-го остатка глутамина [21].Модификация осуществляется специфической метилтрансферазой PrmB [12].

PrmB –первая описанная в литературе метилтрансфераза, мишенью которой является амидныйатом азота.В штамме, содержащем мутацию в гене prmB, отсутствие метилирования в белкеL3 сочетается с чувствительностью к холоду. Скорость роста мутантных клеток при 22ºСзначительно ниже, чем у клеток дикого типа [22,23]. Это связано с тем, что сборкарибосом в мутантных клетках происходит неэффективно в условиях низкой температуры,при этом образующиеся промежуточные рибонуклеопротеидные комплексы отличаютсяпо структуре и стабильности от соответствующих интермедиатов в диком типе в этих жеусловиях.

Характеристики

Список файлов диссертации