Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6 (1105555), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Оба эти белкасвязываются с предшедственниками рибосом и предположительно участвуют в сборкерибосомных частиц [54].Рисунок 1.17. Смоделированная структура комплекса YcfD (показан в виде поверхности)с L16 (показан в виде лент) [54].Фермент YcfD модифицирует белок L16 в свободном состоянии, до его включенияв рибосому. Остаток Arg81 в структуре несвязанного с рибосомой L16 располагается надлинной,гибкойнеструктурированнойпетле,соединяющейсоседниеβ-тяжи(смоделированная структура комплекса YcfD с L16 показана на рис. 1.17). В структурерибосомы эта петля имеет фиксированное положение за счёт взаимодействия с 23S рРНК.Гидроксиллирование остатка Arg81 может обеспечивать образование дополнительнойводородной связи, стабилизирующей комплекс L16 c 23S рРНК [54]. В процессе сборкирибосомы белок L16 встраивается одним из последних [59]. Значит гидроксилированиебелка L16, вероятно, играет важную роль в последних этапах сборки рибосомы.351.6.
Метилтиолирование белка S12Когда химическим путём была определена первичная структура рибосомного белкаS12 E. coli, природа его 88-го аминокислотного остатка так и не была установлена [60].Последующее определение последовательности гена, кодирующего S12, показало, что88-ю позицию занимает аспарагиновая кислота [61]. И только через 20 лет, используямасс-спектрометрию, показали, что молекулярная масса S12 равна 13652 Да (на 46,1 Дабольше, чем было предсказано из последовательности гена) [1]. Дальнейшее изучениеэтого феномена показало, что он обусловлен наличием метилтиоэфирной группы (-SCH3)у β-атома углерода 88-го остатка аспарагиновой кислоты [62].
Ещё позднее был определёнген, который кодирует соответствующую метилтиотрансферазу (rimO), осуществляющуюданную посттрансляционную модификацию (рис. 1.18) [63].Рисунок 1.18. Реакция, катализируемая ферментом RimO. Метилтиолирование остаткаAsp88 белка S12.Эта реакция – пример достаточно редкого в природе ферментативного образованиясвязи С-S из С-Н. Такие реакции осуществляются по радикальному механизму сиспользованием S-аденозилметионина в качестве кофермента [64].S12 – консервативный элемент рибосомы, а остаток Asp88 строго идентичен вовсех известных гомологах S12 в бактериях, археях и эукариотах (хотя модификациянаблюдается не всегда). Asp88 располагается рядом с функциональным центромрибосомы.
Попытки получить мутант по этой аминокислоте не дали положительногорезультата. Всё это указывает на важность этого остатка в функционировании рибосомы.ВсеизвестныедоRimOметилтиотрансферазыпосттранскрипционномодифицируют РНК, RimO – первый изученный фермент этого семейства, мишеньюкоторого являетсябелок.В E.coliпомимоRimO обнаружена толькооднаметилтиотрансфераза, MiaB, модифицирующая тРНК.
Показано сильное сходство ваминокислотных последовательностях этих двух белков [63]. В частности, обе содержатСхххСххС мотив, являющийся каноническим для всего семейства метилтиотрансфераз.36Метилтиолирование белка S12 осуществляется по радикальному механизму(рис. 1.19). На первом этапе разрывается связь С-S в S-аденозилметионине с образованиемсвободного метионина и 5’-дезоксиаденозил-радикала. Затем этот радикал отнимает атомводорода у β-атома углерода остатка Asp88. После этого образуется тиоэфир, который напоследней стадии метилируется.
Таким образом, для модификации одной молекулы белкаS12 требуется две молекулы S-аденозилметионина [65]:Рисунок 1.19. Механизм реакции, катализируемой ферментом RimO [65].Метилирование на последней стадии происходит также с помощью ферментаRimO. Это значит, что он является метилтрансферазой, хотя консервативных Sаденозилметионин связывающих мотивов, характерных для этого семейства ферментов, внём найдено не было [66].Установлена пространственная структура фермента RimO (рис.
1.20). Он состоитиз трёх доменов, N-концевого UPF0004 домена, центрального домена (radical SAM домен)и N-концевого TRAM домена [67]. Последний в схожем ферменте MiaB служит длясвязывания PHK, что может указывать на то, что RimO модифицирует белок S12 в составерибосомы.37Рисунок 1.20. Структура RimO. Домены UPF0004, центральный и TRAM изображены ввиде лент синего, жёлтого и пурпурного цветов, соответственно, кластеры [4Fe-4S] ипентасульфидный мостик в каркасном виде [67].Действительно,экспериментальноподтверждено, что in vivo RimO метилтиолируетостаток Asp88 белка S12, когда последний являетсячастьюмалойсубчастицы[68].Ранеебылоустановлено, что in vitro рекомбинантный RimO изE. coli and T.
maritima может модифицироватьсинтетическийпептидныйсубстрат,которыйРисунок 1.21. Кластер [4Fe-4S] вимитирует петлю, содержащую остаток Asp88, но сструктуре RimO [66].очень низкой эффективностью [69].Кроме того в структуре RimO содержитсядва кластера [4Fe-4S], ковалентно связанных пентасульфидным мостиком (рис. 1.21 и1.22). Первый (RS-кластер), координированый остатками Cys150, Cys154 и Cys157центральногодомена(консервативныйСхххСххСмотив),катализируетвосстановительное расщепление S-аденозилметионина на метионин и радикал 5’дезоксиаденозил. Второй кластер, координированый остатками Cys17, Cys53 и Cys82UPF0004 домена, участвует в образовании С-S связи в субстрате, донором атома серы приэтом может выступать сульфид или метилсульфид-ион [67,70].38Рисунок 1.22.
Структура активного центра RimO. Домены UPF0004, центральный иTRAM изображены в виде лент синего, жёлтого и пурпурного цветов, соответственно,кластеры [4Fe-4S] и пентасульфидный мостик в каркасном виде с атомами железа исеры зелёного и оранжевого цветов, соответственно [67].Помимо фермента RimO в модификации белка S12 принимает участиеконсервативный белок YcaO, функция которого ранее была неизвестна. Нокаут гена ycaOприводит к практически полному подавлению метилтиолирующей активности RimO.Кроме того, транскриптомный анализ штаммов с делецией генов rimO и ycaO показываетперекрывание транскрипционных фенотипов, что говорит функциональном родстве RimOи YcaO.
Белок YcaO связывается с малой субчастицей и, возможно, выполняет функциюшаперона, облегчая образование фермент-субстратного комплекса [68].Следует упомянуть, что после метилтиолирования остатка аспарагиновой кислотыпоявляется новый хиральный центр (β-атом углерода), но его конфигурация до сих пор неустановлена.39Рисунок 1.23. Расположение S12 на малой субчастице. Серым показана рРНК, зелёным –белки, оттенками жёлтого – тРНК, фиолетовым – мРНК, циановым – EF-Tu, синим –белок S12, красными сферами – модифицированный остаток.Белок S12 состоит из глобулярного домена, расположенного рядом с А-участком вдекодирующем центре, и длинного стержнеобразного отростка, который заякориваетбелок на малой субчастице (рис.
1.23). S12 – единственный белок, находящийся наповерхности соприкосновения большой и малой субчастиц. Модифицированный остатокрасполагается вблизи декодирующего центра, но не образует прямых контактов ни смРНК, ни с тРНК. Он погружён в карман, образованный двумя петлями: перваяформируется из 522-528 нуклеотидов 16S рРНК, вторая – из 44-51 аминокислотныхостатков самого S12 (рис. 1.24).40Рисунок 1.24. Положение модифицированного остатка S12 в рибосоме. Серым показанарРНК, зелёным – белки, оттенками жёлтого – тРНК, фиолетовым – мРНК, синим –белок S12, красными сферами – модифицированный остаток.
Циановым показаныостатки, мутации в которых приводят к устойчивости к стрептомицину.Функция модификации S12 до сих пор не выяснена. Известно, что мутации всоседних остатках (Lys87, Ley89, Pro90, Gly91, и Arg93) приводят к появлениюустойчивости к стрептомицину или зависимости от него [63]. Так же известно, что белокS12 принимает участие в самопроизвольной транслокации рибосомы (не зависящей от EFG и GTP), а мутация в соседнем 87-м аминокислотном остатке нарушает эту его функцию[71]. Тем не менее, в случае мутации в гене rimO вышеупомянутых фенотипическихизменений не наблюдается. Единственное отличие такого мутанта от дикого типа –немного сниженная скорость роста [63].411.7. Олигоглутамилирование белка S6Рибосомный белок S6 имеет уникальную разновидность посттрансляционноймодификации.
На его С-конце располагаются от двух до шести остатков глутаминовойкислоты [72,73]. Из них в гене (rpsF) закодированы только первые два [74], остальныедобавляютсяпосттрансляционно.Модификацияпроисходитступенчато,остаткиглутаминовой кислоты добавляются по одной [75].Закодировано в гене S6:…PMVKAKDERRERRDDFANETADDAEAGDSEEАнализ первичной структуры S6: …PMVKAKDERRERRDDFANETADDAEAGDSEE(E)0-4Был получен мутантный штамм, в котором не наблюдается гетерогенности С-концабелка S6 и содержится только 2 остатка глутаминовой кислоты. С помощью этого штаммабыл определён ген, отвечающий за модификацию, названный rimK [76].
Этот ген кодируетфермент массой 31,5 кДа, который узнаёт белок S6 и добавляет дополнительные остатки кего С-концу. В случае мутации в гене rpsF, приводящей к замене предпоследнегоаминокислотного остатка в S6 c глутаминовой кислоты на лизин, посттрансляционноймодификации не наблюдается [77].
Это означает, что RimK узнаёт С-концевой участокбелка S6 дикого типа. В некоторых мутантных штаммах RimK добавляет к S6 большечетырёх остатков глутаминовой кислоты, причины этого не выяснены [77].Установлено, что в условиях, когда не происходит сборка рибосомы (в облучённыхультрафиолетом клетках), модификации S6 не наблюдается [78]. Биоинформатическимиметодами в ферменте RimK найден РНК-связывающий мотив [79].
Эти данные могутуказывать на то, что модификация белка S6 происходит во время или после встраиванияего в рибосому. В первичной структуре RimK был обнаружен АТФ-связывающий мотив[80], что может означать, что фермент является АТФ-зависимой лигазой. Это былоподтверждено in vitro [81], кроме того с помощью ЯМР было показано, что in vitro RimKприсоединяет новые остатки глутамата к белку S6 через классическую пептидную связь (ане через γ-карбоксильную группу глутаминовой кислоты) [81].ПространственнаяструктураферментаRimKбылаизученаспомощьюрентгеноструктурного анализа [82] (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
