Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6 (1105555), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Нокаут генов, кодирующихрибосомные гибернационные факторы, как правило, приводит к снижению выживаемостиклеток в стационарной фазе. Нами показано, что одним из способов подавлениятрансляции также является олигоглутамилирование белка S6.652.5. Влияние модификации белка S6 на выживаемость бактериальнойкультуры в условиях дефицита ресурсовМы показали, что фермент RimK в случае дефицита ресурсов во внешней средеосуществляет посттрансляционную модификацию рибосомного белка S6, что приводит кингибированию энергозатратного для клетки процесса трансляции. Насколько это важнодля выживания клетки? Мы провели ряд экспериментов, ставящих целью сравнитьвыживаемость клеток дикого типа и ∆rimK в условиях недостатка ресурсов.
В первомэксперименте мы инкубировали клетки дикого типа и ∆rimK в отдельных пробирках при37°С в богатой среде LB в течение 12 дней в аэробных условиях. Раз в сутки мы измеряликлеточный титр. Результаты показаны на рис. 2.16.Рисунок. 2.16. Выживаемость клеток дикого типа и ∆rimK в стационарной фазе.Первые 6 дней клеточный титр в случае обоих штаммов монотонно уменьшался,причем на 6-й день титр клеток ∆rimK стал примерно в два раза меньше, чем клетокдикого типа.
На 7-й день количество живых клеток дикого типа в культуре начинаетувеличиваться. Это явление описано в литературе и известно как фенотип ростовогопреимущества в стационарной фазе (growth advantage in stationary phase – GASP фенотип)[93]. Этот фенотип объясняется накоплением в культуре клеток мутаций и, как следствие,появление мутантов, способных использовать в качестве питательных ресурсов мёртвыебактериальные клетки. Такие мутанты получают преимущество и начинают расти иделиться. В клетках ∆rimK, в которых нет модификации белка S6, GASP фенотип66появляется на 2 дня позже. Такое замедление должно негативно сказаться на выживанииклеток в условиях конкуренции за ресурсы с другими штаммами.
В следующемэксперименте мы также инкубировали клетки дикого типа и ∆rimK при 37°С в богатойсреде LB в течение 12 дней в аэробных условиях, но уже в одной пробирке, то естьштаммы конкурировали между собой за питательные ресурсы. Титр клеток дикого типа и∆rimK определяли с помощью высевания стерильных разведений культуры на среду сагаром без антибиотика и с канамицином, соответственно.
Результаты показаны нарис. 2.17.Рисунок 2.17. Выживаемость клеток дикого типа и ∆rimK в стационарной фазе присовместном культиваровании.В этом случае только клетки дикого типа успевают проявить GASP фенотип, чтоприводит к полному вытеснению ими клеток ∆rimK из культуры. В случае ежедневногопересева в свежую среду смешенной культуры клеток дикого типа и ∆rimK, доляпоследних монотонно падает (рис. 2.18).67Рисунок 2.18. Вытеснение клеток ∆rimK клетками дикого типа при совместномкультивировании и ежедневных пересевах.Бактериальной клетке нужно уметь приспосабливаться к дефициту питательныхвеществ.
В первую очередь ей необходимы механизмы экономии ресурсов. Клетки, вкоторых такие механизмы работают лучше, оказываются более приспособленными, азначит, обладают конкурентным преимуществом. Описанные результаты наглядноиллюстрируют это положение.682.6. Связь модификации белка S6 c образованием спящихбактериальных клетокВ отличие от лабораторных условий культивирования в естественных условияхбактерии гораздо больше времени проводят в стационарной фазе. Одна из стратегийвыживания бактериальных популяций заключается в образовании спящих форм [94]. Втаких спящих состояниях в клетках сильно снижен метаболизм, такие клеткинечувствительныкантибиотикам.Когдавнешниеусловиястановятсяболееблагоприятными для роста и деления клеток, популяция разделяется на две субпопуляции:часть клеток активно делится, остальные клетки так и остаются спящими. Привоздействии на такую популяцию клеток неблагоприятных факторов, в частности,антибиотиков, активно делящиеся клетки погибают, а спящие продолжают оставаться всвоём «законсервированном состоянии», тем самым сохраняя жизнеспособность долучших времён.
Одним из механизмов образования спящих клеток является повышенныйуровень синтеза белков, которые токсичны и ингибируют рост, но при этом не вызываютгибель клеток. Токсин HipA, который фосфорилирует глутамил-тРНК синтетазу и темсамым ингибирует трансляцию, обеспечивает образование спящих клеток [95]. ТоксиныRelE и MazF расщепляют мРНК, что приводит к её деградации в клетке, а значит и кподавлениюсинтезабелка.Этитоксины,иранееописанныйрибосомныйгибернационный фактор RMF так же способствуют переходу клетки в спящеесостояние.[94]Действуя на бактериальную культуру антибиотиком (ампициллином) в течениеограниченного времени и измеряя титр выживших клеток, можно определить долюспящих клеток в данной культуре.Используя описанный ампициллиновый тест, мы сравнили долю спящих клеток вкультурах штаммов дикого типа и ∆rimK (рис.
2.19). Оказалось, что доля спящих клеток внокаутном штамме в 100 раз ниже, чем в штамме дикого типа. Отсутствиеолигоглутамилирования белка S6 негативным образом сказывается на образованииспящих форм клеток.69Рисунок 2.19. Доля выживших (спящих) клеток дикого типа и ∆rimK после добавления ксреде ампициллина.Для проверки данной гипотезы мы решили проанализировать популяцию двухштаммов, флуоресцентно промаркировав спящие клетки. В качестве маркера мыиспользовали плазмиду, содержащую ген флуоресцентного белка таймера FastFT, длякоторого характерны две ступени созревания.
Первая ступень, характеризующаясявременем полуреакции 0,25 часа, приводит к флуоресценции белка в синей области.Вторая ступень, с периодом полуреакции 7 часов, ведёт к сдвигу спектра флуоресценции вкрасную область. Используя проточную цитометрию, можно отличить спящие клетки (вних весь FastFT будет в красной форме) от активно синтезирующих белок (такие клеткибудут содержать голубую форму белка-таймера). Схема эксперимента показана нарис.
2.20, а схематичное изображение результатов цитометрии на рис. 2.2170Рисунок 2.20. Схема эксперимента с флуоресцентным белком-таймером FastFT. Напервом этапе клетки растут в среде с арабинозой до тех пор, пока весь FastFT неперейдёт в красную форму. После разбавления клеток свежей средой с индукторомклетки начинают синтезировать новый белок FastFT синего цвета.Плазмиду, содержащую ген FastFT, мы внесли в клетки дикого типа и ∆rimK.Трансформированные клетки инкубировали в среде с индуктором в течение 48 часов.Этого времени достаточно, чтобы весь синтезированный в логарифмической фазе ростабелок FastFT перешёл в красную форму. Полученные культуры мы проанализировали спомощью проточной цитометрии (рис. 2.22). Клетки дикого типа в стационарной фазепрекращают синтезировать новый белок (в них присутствует только красная формаFastFT), в то время как клетки ∆rimK сохраняют небольшую трансляционную активность(помимо красной формы белка-таймера в них содержится в том числе и недавносинтезированный FastFT в голубой форме).
Этот результат является независимымподтверждением сделанного нами ранее вывода о влиянии олигоглутамилирования белкаS6 на трансляцию в стационарной фазе.71Рисунок 2.21. Схематичное изображение результатов проточной цитометрии. Спящиеклетки располагаются в левом верхнем углу.При разбавлении полученных культур свежей средой клетки дикого типа и ∆rimKведут себя по-разному. Проточная цитометрия показала, что через час после помещения всвежую среду, клетки дикого типа разделяются на две субпопуляции: большая частьклеток остаётся в спящей форме, а примерно 10% популяции начинают синтезироватьновый белок-таймер. В дальнейшем, эти клетки активно делятся и образуют новуюпопуляцию клеток в логарифмической фазе роста, доля спящих клеток постепенносокращается, но их количество, по-видимому, остаётся постоянным.
При этом культура∆rimK не разделяется на субпопуляции. Практически все клетки ∆rimK штамма начинаютсинтезировать новый белок FastFT. Спящих клеток детектировать не удаётся.Через 2 часа инкубации в свежей среде клетки дикого типа начинают делиться (приделении уменьшается сигнал красной формы FastFT в активно метаболизирующихклетках). Клетки ∆rimK продолжают синтезировать новый белок-таймер без деления, ониначинают делиться только через 4 часа после помещения в новую среду.72Рисунок 2.22. Результаты проточной цитометрии клеток дикого типа и ∆rimK,синтезирующих флуоресцентный белок-таймер FastFT.73Рисунок 2.22 (продолжение). Результаты проточной цитометрии клеток дикого типа и∆rimK, синтезирующих флуоресцентный белок-таймер FastFT.74Рисунок 2.22 (продолжение). Результаты проточной цитометрии клеток дикого типа и∆rimK, синтезирующих флуоресцентный белок-таймер FastFT.75Интересноотметить,чтоморфологияклетокдикоготипаи∆rimK,экспрессирующих FastFT, сильно отличается (рис.
2.23). На изображениях, полученныхметодом флуоресцентной микроскопии, видно, что клетки дикого типа в стационарнойфазе имеют характерную для E. coli вытянутую форму, красный FastFT равномерноРисунок2.23.Морфологияклетокдикоготипаи∆rimK,экспрессирующихфлуоресцентный белок-таймер FastFT. Синие области соответствуют недавносинтезированному FastFT, красные – старому FastFT. (А) Клетки дикого типа встационарной фазе.
(B) Клетки ∆rimK в стационарной фазе. (C, E) Клетки дикого типачерез 1 и 7 часов после разбавления свежей средой с арабинозой, соответственно. (D, F)Клетки ∆rimK через 1 и 7 часов после разбавления свежей средой с арабинозой,соответственно.76распределён по объёму клетки. Клетки ∆rimK в аналогичных условиях имеют оченьнеобычнуюморфологию,онисильноудлинены,центральнаячастьзаполненасинтезированным в логарифмической фазе роста красным FastFT. На периферии клеткинаблюдаются локусы, заполненные недавно синтезированным голубым FastFT. Припомещении клеток ∆rimK в свежую среду, эти локусы начинают увеличиваться вразмерах.
В клетках дикого типа такого разделения клетки не наблюдается, а новыйбелок-таймер начинает равномерно синтезироваться по всему объёму цитоплазмы.Для перехода клетки в спящее состояние ей нужно свести к мининуму всеклеточные процессы, требующие затрат энергии, в том числе и процесс биосинтеза белка.Как мы показали ранее, олигоглутамилирование белка S6 приводит к снижениютрансляционной активности рибосомы. Видимо, поэтому в клетках из штамма ∆rimKмеханизм образования спящих клеток нарушен.77ЗаключениеВ естественных условиях бактерии редко сталкиваются с изобилием питательныхвеществ, гораздо чаще приходится иметь дело с дефицитом ресурсов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
