Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6 (1105555), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Штаммы и плазмидыТаблица. 3.1. Использованные в работе штаммы.ШтаммBW25113ОписаниеlacIq rrnBT14 ∆lacZWJ16 hsdR514 ∆araBADAH33Ссылка[97]∆rhaBADLD78JW0836lacIq rrnBT14 ∆lacZWJ16 hsdR514 ∆araBADAH33[98]∆rhaBADLD78, ∆rimK::kanJM109e14- (McrA-) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rK- mK+)supE44 relA1 (lac-proAB) [F' traD36 proAB lacIqZ M15]BL21 (DE3)F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal λDE3∆rimK-S6-E4-catlacIq rrnBT14 ∆lacZWJ16 hsdR514 ∆araBADAH33∆rhaBADLD78, ∆rimK::kan, ∆rpsF::(rpsFE4-cat)∆rimK-S6-catlacIq rrnBT14 ∆lacZWJ16 hsdR514 ∆araBADAH33∆rhaBADLD78, ∆rimK::kan, ∆rpsF::(rpsF-cat)84InvitrogenТаблица 3.2. Плазмиды, использованные в работеПлазмидаОписаниеСсылкаpCA24rpsFpCA24N, CamR, ген rpsF под контролем T5lac промотора[99]pET-33bpBAD-FastFTNovagenpBAD, Ampr, ген FastFT под контролем арабинозного[100]промотора3.1.4. ОлигонуклеотидыТаблица3.3.
ДНК-олигонуклеотиды, использованные в работе.НазваниеНуклеотидная последовательность (5’ - 3’)олигонуклеотидаS6-N-pr1CATAGTTAATTTCTCCTCTTTAATGS6-N-pr2CGTCATTACGAAATCGTTTTTATGS6-QCFAAGCTGGGGATTCTGAAGAGTAAGGGTCGACCTGCAGCCAS6-QCRTGGCTGCAGGTCGACCCTTACTCTTCAGAATCCCCAGCTTS6-QCEFAAGCTGGGGATTCTGAAGAGGAAGAGGAAGAGTAAGGGTCGACCTGCAGCCAS6-QCERTGGCTGCAGGTCGACCCTTACTCTTCCTCTTCCTCTTCAGAATCCCCAGCTTSeq-pCA24N_982revCTAATTAAGCTTGGCTGS6-ins-fGTCATTACGAAATCGTTTTTATGS6-ins-rGCACACGGTGCCGGACAACACCAGACGGTTGGTCATCAGAAATTACGCCCCGCCCTGCCS6-ver-fACAGGAGGCTGAATAATCCGS6-ver-rGAATTCCTGATGGACTGACCrimK-pr1CCATGGTCAAAATTGCCATATTGTCCCGGrimK-pr2GTCGACACCACCCGTTTTCAGGCAATT7-prom-seqTAATACGACTCACTATAGGG853.2. Методики, использованные в работе3.2.1. Манипуляции с ДНК3.2.1.1. Выделение плазмидной ДНКВыделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора реагентов длявыделения плазмидной ДНК фирмы Fermentas согласно протоколу с использованиемфирменных растворов.Колонию клеток E.
coli, несущую определенную плазмиду, помещали в 5 мл средыLB, содержавшей соответствующий антибиотик, и инкубировали при перемешивании втечение 16 ч при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием при 7000 об/мин 5 мин,ресуспендировали в 250 мкл Resuspension Solution (Fermentas), добавляли 250 мкл LysisSolution (Fermentas), перемешивали, переворачивая пробирку, до образования вязкогопрозрачного раствора. К полученному раствору добавляли 350 мкл Neutralization Solution(Fermentas), перемешивали, переворачивая пробирку, до появления белого хлопьевидногоосадка.
Осадок удаляли центрифугированием при 14000 об/мин в течение 5 мин, отбиралисупернатант и пропускали его через специальную колонку для выделения ДНК(Fermentas), два раза промывали эту колонку 500 мкл Wash Solution (Fermentas), затемцентрифугировали при 14000 об/мин для удаления следов этанола. Плазмидную ДНКэлюировали с колонки 50 мкл Elution Buffer (Fermentas).3.2.1.2.
Определение концентрации ДНК в растворе.Отбирали 5–10 мкл раствора ДНК (плазмидная ДНК, ПЦР-фрагменты, праймеры) вводе или в буферном растворе EB (Qiagen), добавляли до 100 мкл раствор 0,1 М Tris-HClpH 8,0, измеряли поглощение полученного раствора при 260 нм. Полученное значениеА260 с учетом разбавления пересчитывали в значение концентрации ДНК мкг/мкл. Принеобходимости рассчитывали значение концентрации ДНК в единицах пмоль/мкл.3.2.1.3. Рестриктный анализ плазмидной ДНКСоставляли следующую реакционную смесь:Раствор плазмидной ДНК1 мкл10х буфер для эндонуклеазы рестрикции1 мклЭндонуклеаза рестрикции1 едН2Одо 10 мклПолученную смесь инкубировали при 37˚С в течение 1 ч.
Добавляли 2 мкл 6хбуфера для нанесения, наносили на агарозный гель и приводили разделение фрагментовДНК. Распределение фрагментов по длине определяли с помощью камеры с УФ-лампой.863.2.1.4 Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле [101]Для приготовления агарозного геля добавляли 0,8–1,0 г агарозы к 100 мл раствора1xTBE. Раствор прогревали в микроволновой печи до полного растворения агарозы, но недопуская кипения. После этого полученный раствор охлаждали до ~ 40–50°С, добавляли10 мкл водного раствора бромистого этидия 10 мг/мл, перемешивали, выливали в плашку.После застывания геля вносили образцы, смешанные с буфером для нанесения, в ячейки ипроводили электрофорез при силе тока ~ 100–150 мА. Разделение фрагментов ДНКконтролировали с помощью камеры с УФ-лампой.3.2.1.5.. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геляВыделение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили с помощью наборареагентов для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля фирмы Fermentas согласнопротоколу с использованием фирменных реагентов.Из агарозного геля вырезали полоску, содержавшую нужный фрагмент ДНК,взвешивали и помещали в пластиковую пробирку на 1,5 мл.
Добавляли Binding Buffer(Fermentas) в отношении 1:1 (объём раствора к массе полоски геля). Инкубировалипробирку при 50-60°С в течение 10 мин, перемешивая каждые 2-3 мин, до полногорастворения геля. Переносили полученный раствор в специальную колонку длявыделения ДНК и центрифугировали при 14000 об/мин 1 мин. Промывали колонку700 мкл Wash Solution (Fermentas).
Элюировали ДНК 50 мкл Elution Buffer (Fermentas).Качество выделения и приблизительную концентрацию ДНК определяли с помощьюэлектрофореза в агарозном геле.3.2.1.6. Приготовление вектора и вставки [101]Составляли следующую реакционную смесь:Плазмидная ДНК1–4 мкг10х буфер для эндонуклеазы рестрикции4 мклЭндонуклеаза рестрикции1 млкН2Одо 40 мклПолученную смесь инкубировали при 37˚С в течение 2–4 ч. Добавляли 8 мклбуфера для нанесения, наносили на агарозный гель и проводили электрофорез при 100150 мА. ДНК-фрагмент нужной длины вырезали из геля и выделяли с помощью наборареагентов для выделения ДНК из агарозного геля (Fermentas).3.2.1.7.
Лигирование [101]Составляли следующую реакционную смесь:Вектор20 нг87Вставка10–50 нг (3х–10х мольный избыток поотношению к вектору)10х буфер для Т4 ДНК-лигазы1 мклН2Одо 10 мклСмесь перемешивали, добавляли 1 ед. Т4 ДНК-лигазы. Инкубировали прикомнатнойтемпературевтечение2-3 ч.Полученнымилигазнымисмесямитрансформировали компетентные клетки штамма JM109 E. coli.3.2.1.8. ПЦР.Обычно в пробирке 0,5 мл составляли следующую смесь:10х буферный раствор для Taq-полимеразы5 мклматричная ДНК (плазмидная или геномная)5–50 нгпраймер 15–20 пмольпраймер 25–20 пмольсмесь dNTPпо 0,2 мМ каждогоMg(OAc)22,5 мМН2Одо 49 мклДобавляли 1 мкл Taq-полимеразы (1 ед/мкл), тщательно перемешивали.
Помещалипробирку в прибор для проведения ПЦР Mastercycler gradient фирмы Eppendorf.Параметры ПЦР:предварительный прогрев95°С, 3 мин,25–35 циклов:95°С, 1 мин,55–65°С, 1 мин,72°С, 1–5 мин.После проведения ПЦР в смесь добавляли 10 мкл буфера для нанесения, проводилиразделение фрагментов ДНК в 1% агарозном геле.3.2.1.9. Мутагенез с помощью набора QuickChange (Stratagene)В пробирке 0,2 мл составляли следующую смесь:10х буферный раствор (из набора)5 мклплазмидная ДНК5 нгпраймер 1125 нгпраймер 2 (комплементарный)125 нгсмесь dNTP (из набора)1 мклН2Одо 49 мкл88Добавляли 1 мкл PfuTurbo-полимеразы (2,5 ед/мкл), тщательно перемешивали.Помещали пробирку в прибор для проведения ПЦР Mastercycler gradient фирмыEppendorf.Параметры ПЦР: предварительный прогрев95°С, 30 c,12-18 циклов:95°С, 30 c,55°С, 1 мин,68°С, 2мин/1000 парнуклеотидов плазмиды.После проведения ПЦР проводили трансформацию компетентных клеток E.coliштамма JM-109.3.2.1.10.
Секвенирование плазмид и ПЦР-продуктовНуклеотидную последовательность полученной плазмиды определяли с помощьюавтоматического секвенатора ABI prism 3100-Avant genetic Analyzer (4-х капиллярный).Дляпроведениясеквенированияобразцы,содержащиеанализируемуюДНКисоответствующий праймер, отдавали в Центр Коллективного Пользования «Геном»(Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН).3.2.1.11. Приготовление компетентных клеток [102]Несколько колоний клеток переносили в колбу с 50 мл LB, растили приинтенсивном перемешивании при 18ºС до A600~0,6. После этого клетки охлаждали во льдув течение 10 мин и осаждали центрифугированием при 4000 об/мин 10 мин при 4°С.Сливали супернатант, центрифугировали повторно при 4000 об/мин 10 мин при 4°С.Отбирали остатки супернатанта и ресуспендировали осадок клеток в 15 мл TB,полученную суспензию инкубировали 10 мин при 0ºС.
Центрифугировали суспензию при3000 об/мин10 минпри4°С,сливалисупернатант,послечегоповторноцентрифугировали при 3000 об/мин 10 мин при 4°С и отбирали остатки супернатанта.Полученный промытый осадок клеток ресуспендировали в 2 мл TB, добавляли70 мкл ДМСО и инкубировали полученную суспензию 10 мин при 0ºС. После этогодобавляли к суспензии ещё 70 мкл ДМСО и снова инкубировали 10 мин при 0ºС.Полученные таким образом компетентные клетки аликвотили по 200 мкл и замораживалив жидком азоте.3.2.1.12. Трансформация компетентных клетокСуспензию компетентных клеток размораживали во льду, добавляли 1 мклраствора плазмидной ДНК или 10 мкл лигазной смеси, инкубировали 30 мин при 0°С.89Затем прогревали смесь на водяной бане в течение 40–50 сек при 42°С, охлаждали до 0°С,добавляли 500 мкл LB и инкубировали 1 час при 37°С, интенсивно перемешивая.Аликвоту 100–200 мкл (в случае плазмидной ДНК) или полный объем (в случае лигазнойсмеси) трансформационной смеси высевали на чашку Петри с твердой средой LB,содержавшей соответствующие антибиотики.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
