Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6 (1105555), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Инкубировали чашку при 37°С в течение16 ч.3.2.2. Получение модельных штаммов ∆rimK-S6-cat и ∆rimK-S6-E4-cat3.2.2.1. Получение кассеты для трансформацииЗа основу для кассеты была взята плазмида pCA24N-rpsF [99]. Эта плазмидасодержит в себе ген rpsF, кодирующий рибосомный белок S6, и ген устойчивости кхлорамфениколу. Ген rpsF в этой плазмиде содержит N- и C-концевые довески. На первомэтапе требовалось удалить эти довески с обоих концов гена rpsF, а также внестидополнительные кодоны глутаминовой кислоты в конец гена. N-концевой довесок в генеrpsF был удалён с помощью ПЦР с плазмиды pCA24N-rpsF с праймерами S6-N-pr1 и S6N-pr2 и последующего самолигирования ПЦР-продукта.
Праймеры были подобраны так,чтобы в ПЦР амплифицировалась вся плазмида кроме дополнительных кодонов в началегена rpsF (N-концевого довеска).Удаление дополнительных кодонов в конце гена rpsF а также внесение 4-х кодоновглутаминовой кислоты в конец гена осуществлялось посредством сайт-направленногомутагенеза с помощью набора QuickChange (Stratagene) с праймерами S6-QCF и S6-QCRили S6-QCEF и S6-QCER. В случае первой пары праймеров происходило удалениекодонов, кодирующих C-концевой довесок, а в случае второй, помимо удаления довескаосуществлялась также и вставка 4-х дополнительных кодонов глутаминовой кислоты.Полученные плазмиды были секвенированы с праймером Seq-pCA24N_982rev.Таким образом были получены две плазмиды, первая с нативным вариантом генаrpsF, а вторая – с геном rpsF, кодирующем белок S6 c четырьмя дополнительнымиостатками глутаминовой кислоты на С-конце.
Эти плазмиды служили матрицами для ПЦРс праймерами S6-ins-f и S6-ins-r. В результате были получены две кассеты, содержащиемодифицированный/немодифицированныйвариантS6игенустойчивостикхлорамфениколу. Кассеты на концах содержали фланки, идентичные участкам геномнойДНК, в которые они были вставлены.3.2.2.2.
Внесение кассеты в геномную ДНКЗа основу была взята методика получения нокаутных штаммов E. coli [97]. Клетки∆rimKтрансформировалиплазмидойpKD46.90Изполученныхтрансформантоввыращивали ночную культуру в SOB c ампициллином при 30ºС.
1 мл ночной культурыразбавляли 100 мл SOB c ампициллином и 10мМ арабинозой, растили при интенсивномперемешивании при 30ºС до A600~0,6. После этого клетки осаждали центрифугированиемпри 4000 об/мин 10 мин при 4°С. Сливали супернатант, центрифугировали повторно при4000 об/мин 10 мин при 4°С. Отбирали остатки супернатанта и ресуспендировали осадокклеток в 50 мл 10% раствора глицерина в деионизованной воде. Центрифугировалисуспензию при 4000 об/мин 10 мин при 4°С, сливали супернатант, после чего повторноцентрифугировали при 4000 об/мин 10 мин при 4°С и отбирали остатки супернатанта.Повторяли описанную выше процедуру промывки клеток 10% глицерином.Полученный промытый осадок клеток ресуспендировали в 0,4 мл 10% раствораглицерина в деионизованной воде, суспензию аликвотили по 100 мкл и замораживали вжидком азоте.К аликвоте электрокомпетентных клеток ∆rimK добавляли 10 мкл раствора ДНКкассеты и осуществляли электропорацию (1800 В).
После электропорации к суспензиидобавляли 4-х кратный объём SOC, инкубировали при 37°С и высевали полученнуюсуспензию на чашку Петри с твердой средой LB, содержавшей канамицин ихлорамфеникол. Инкубировали чашку при 37°С в течение 24 ч.3.2.2.1. Анализ полученных клоновПолученные колонии высевали в жидкую среду LB, выращивали ночные культуры.5 мклночнойкультурыпомещалив0,2 млпробирку,клеткиосаждалицентрифугированием 3000 об/мин, 5 минут, отбирали супернатант. Полученный осадокресуспендировали в 10 мкл реакционной смеси и проводили ПЦР с праймерами S6-ver-f иS6-ver-r. Длину полученного ПЦР-продукта определяли с помощью электрофореза вагарозном геле.
В случае успешной вставки кассеты в геномную ДНК полученный ПЦРпродукт секвенировали.3.2.3. Получение плазмиды для экспрессии гена rimKПлазмиду pET-33b (Novagen), обработанную эндонуклеазами рестрикции NcoI иXhoI, использовали в качестве вектора. Вставкой служил обработанный эндонуклеазамирестрикции NcoI и SalI ПЦР-продукт, полученный в результате ПЦР с геномной ДНК изклеток дикого типа с праймерами rimK-pr1 и rimK-pr2.
Проводили лигорование вектора ивставки и трансформацию продуктом лигирования компетентных клеток JM109.Полученную плазмиду секвенировали, используя праймер T7-prom-seq. Для выделениярекомбинантного RimK использовали штамм BL21 (DE3).913.2.4. Работа с клеточными культурами3.2.4.1. Определение титра клеток1 мкл культуры разводили стерильной средой LB до 100 мкл. Далее проводилипоследовательные разбавления культуры с шагом в 10 раз стерильной средой LB, получаятаким образом ряд разбавлений 102-107.
По 5 мкл из каждого образца разбавленнойкультуры высевали чашки Петри с LB. Чашки инкубировали при 37°С в течении ночи,считали количество колоний клеток и рассчитывали клеточный титр.3.2.4.2. Измерение выживаемости клеток в стационарной фазе ростаИнокулировали 10 мл среды LB колонией клеток дикого типа или ∆rimK. Культурувыращивали при 37°С и умеренном перемешивании в течение 14 суток. Раз в суткиотбирали 1 мкл культуры для измерения клеточного титра.В случае измерения выживаемости клеток дикого типа и ∆rimK при совместномкультивировании, образцы разбавленной культуры высевали на чашки Петри с LB безантибиотика и с канамицином, селективно ингибирующим рост клеток дикого типа, но неклеток ∆rimK.
После инкубации чашек при 37°С в течении ночи, считали количествоколоний клеток и рассчитывали титр клеток дикого типа и ∆rimK3.2.4.3. Измерение скорости вытеснения клеток ∆rimK клетками дикого типа присовместном культивированииИнокулировали 5 мл среды LB колонией клеток дикого типа. В другой пробирке,инокулировали 5 мл среды LB колонией клеток ∆rimK. После выращивания в теченииночи при 37°С и умеренном перемешивании, культуры клеток смешивали и использовали10 мкл смеси для инокуляции 10 мл среды LB. Смесь клеток двух штаммов выращивали втечении ночи при 37°С и умеренном перемешивании. Использовали 10 мкл полученнойкультуры для инокуляции 10 мл среды и цикл роста повторяли. Проводили 12 цикловроста.После каждого цикла, 1 мкл культуры использовали для определения титра клетокLB.
Образцы разбавленной культуры высевали на чашки Петри с LB без антибиотика и сканамицином, селективно ингибирующим рост клеток дикого типа, но не клеток ∆rimK.После инкубации чашек при 37°С в течении ночи, считали количество колоний клеток ирассчитывали титр клеток дикого типа и ∆rimK.3.2.4.4. Определение количества спящих клеток (ампициллиновый тест)Клетки растили в LB до A600~0,6, после чего к культуре добавляли ампициллин(50 мкг/мл), инкубировали при 37°С и умеренном перемешивании и определяли титр92клеток через разные промежутки времени. Для сравнения использовали клеточный титрисходной культуры без антибиотика.3.2.4.5.
Определение количества спящих клеток c помощью проточной цитометрииКлетки дикого типа и ∆rimK трансформировали плазмидой pBAD-FastFT.Полученными колониями инокулировали 5 мл среды LB с ампициллином и 10 мМарабинозой и инкубировали при 37°С и умеренном перемешивании в течение 2 суток.1 мл полученной культуры разбавляли в 100 мл среды LB с ампициллином и 10 мМарабинозой и инкубировали при 37°С и умеренном перемешивании.
Через каждый часотбирали аликвоту культуры, осаждали клетки центрифугированием при 5000 об/мин,промывалиосадокресуспендированиемвстерильномфильтрованномPBSипоследующем центрифугированием при 5000 об/мин. Осадок клеток ресуспендировали встерильном фильтрованном PBS и анализировали на цитометре FacsAria III (BectonDickinson and Company). Для детекции голубой формы белка FastFT использовали лазер сдлиной волны 405 нм и фильтр 450/20 нм, а для детекции красной формы использовалилазер с длиной волны 561 нм и фильтр 610/10 нм.3.2.5. Выделение рибосом, белков, клеточных экстрактов3.2.5.1. Выделение фракции рибосомК 400 мл среды LB добавляли 4 мл свежей ночной культуры клеток иинкубировали при 37ºC и перемешивании 180 об/мин до A600 0,5-0,8.
Клетки охлаждали вольду в течение 20 мин (все дальнейшие манипуляции проводили при +4°С) и осаждалицентрифугированием при 5000 об/мин 10 мин в роторе JA-10 в препаративной центрифугеBeckman. Осадок ресуспендировали в 10 мл охлажденного связывающего буфера,суспензию центрифугировали, сливали супернатант. Промытый осадок ресуспендировалив 3 мл связывающего буфера.
Суспензию обрабатывали ультразвуком во льду 4 раза по15 сек с перерывом в 45 сек.КлеточныйдебрисосаждалицентрифугированиемвротореJA-20при15000 об/мин в течение 30 мин в препаративной центрифуге Beckman. Супернатантнаносили на градиент сахарозы 10-40%. Центрифугирование в сахарозном градиентепроводили на ультрацентрифуге Beckman L7-55 в роторе SW-32-Ti при 18000 об/мин втечение 16 ч. 70S фракцию рибосом собирали в отдельную пробирку, доводили донужногообъемарастворомсахарозывсвязывающембуфереиосаждалицентрифугированием при 70000 об/мин в роторе MLA-80 в течение 1 часа. Сливалисупернатант, осадки растворяли в связывающем буфере, определяли оптическую93плотность полученного раствора при 260 нм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
