Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6 (1105555), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Диализный мешок выдерживали вводе 30 минут, переносили в неё раствор белка и диализовали против 1 л буфера длядиализа в течении 12 часов при +4ºС. После этого разделяли полученный белок нааликвоты по 100 мкл и хранили при –80оС. Чистоту выделяемого белка определяли спомощью белкового электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях.3.2.5.10. Приготовление клеточного экстракта S30Колонию клеток переносили в 4 мл LB. Растили при 37ºС в течение 16 ч.Полученную культуру переносили в колбу с 400 мл LB и растили при 37ºС до A600 ~ 0,5.Клетки осаждали центрифугированием при 5000 об/мин 10 мин, сливали супернатант,97осадок ресуспендировали в 10 мл буфера для промывки. Полученную суспензиюцентрифугировали 5000 об/мин 10 мин, сливали супернатант, осадок ресуспендировали в3 мл буфера для лизиса.
Ресуспендированные клетки лизировали ультразвуком, после чегоосаждали дебрис центрифугированием при 30000 g в течение 30 мин. Супернатанталиквотили в пластиковые пробирки на 1,5 мл и замораживали в жидком азоте.3.2.5.11. In vitro трансляция.In vitro трансляцию осуществляли по описанной методике [105]. В качествематрицы использовали мРНК люцеферазы сверчка, S100 экстракт E. coli и рибосомы,выделенные из клеток дикого типа и ∆rimK.
Состав реакционной смеси:1) S100 экстракт E. coli – 3 мкл;2) раствор А – 4 мкл;3) рибосомы – 5 пмоль;4) мРНК – 100 пмоль;5) связывающий буфер для выделения рибосом – до 10 мкл общего объёма.Реакционную смесь инкубировали при 37ºС в течение 10 минут. Реакциюостанавливали добавлением к реакционной смеси раствора рибонуклеазы А. Измерениеактивности люциферазы осуществляли с помощью набора реагентов для анализаактивности люцифераз фирмы Promega согласно протоколу с использованием фирменныхрастворов. К 10 мкл реакционной смеси добавляли 50 мкл Luciferase Assay Reagent II(Promega) и измеряли люминесценцию на плашечном ридере Victor, Perkin-Elmer.3.2.5.12.
Проведение модификации белка S6 in vitroСоставляли реакционную смесь:1)предполагаемый субстрат (70S, 30S или 100S рибосомы, суммарныйрибосомный белок или S30 экстракт) – объём, содержащий 10 пмоль белкаS6;2)фермент RimK – 1 пмоль;3)АТФ – 1 мкл (100 ммоль);4)145)реакционный буфер – до 20 мкл общего объёма.С-меченная глутаминовая кислота – 5 мкл (1 ммоль);Смесь перемешивали и инкубировали при 37ºС в течение 1 часа. После этого ксмеси добавляли 5 мкл 5X буфера для нанесения образца на ПААГ и инкубировали5 минут при 95ºС.984. Выводы1.ПоказанаолигоглутамилированрегуляциявмодификациистационарнойфазерибосомногоростаинебелкаS6.модифицированS6влогарифмической.2. Установлено, что олигоглутамилирование рибосомного белка S6 необратимо.При переходе культуры клеток из стационарной фазы роста в логарифмическуюмодифицированный белок разбавляется вновь синтезированным немодифицированнымS6.3.
Создана система in vitro модификации рибосомного белка S6. Для модификациибелка S6 используется свободная глутаминовая кислота и АТФ.4. Установлено, что белок S6 олигоглутамилируется только в составе ужесобранной рибосомы, свободный белок S6 не подвергается модификации.5. Продемонстрировано, что олигоглутамилирование белка S6 в стационарной фазероста приводит к снижению активности рибосомы.6. Обнаружено, что модификация белка S6 способствует переходу бактериальнойклетки в «спящее» состояние.99Список литературы1. R.J. Arnold, J.P. Reilly. Observation of Escherichia coli ribosomal proteins and theirposttranslational modifications by mass spectrometry.
// Anal Biochem. 1999. V. 269. P.105-112.2. A. Ben-Bassat, K. Bauer, S.Y. Chang, K. Myambo, A. Boosman, S. Chang. Processing of theinitiation methionine from proteins: properties of the Escherichia coli methionineaminopeptidase and its gene structure. // Journal of Bacteriology. 1987. V. 169. P. 751757.3. F.N. Chang, C. Budzilowicz. Characterization of methylated neutral amino acids fromEscherichia coli ribosomes. // Journal of Bacteriology. 1977.
V. 131. P. 105-110.4. J. Brosius. Primary structure of Escherichia coli ribosomal protein L31. // Biochemistry. 1978.V. 17. P. 501-508.5. A.J. Eistetter, P.D. Butler, R.R. Traut, T.G. Fanning. Characterization of Escherichia coli 50Sribosomal protein L31. // FEMS Microbiology Letters. 1999. V. 180. P. 345-349.6. K. Makarova, V. Ponomarev, E. Koonin. Two C or not two C: recurrent disruption of Znribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer inevolution of bacterial ribosomal proteins. // Genome Biology.
2001. V. 2. P. 1-14.7. S.E. Gabriel, J.D. Helmann. Contributions of Zur-controlled ribosomal proteins to growthunder zinc starvation conditions. // J Bacteriol. 2009. V. 191. P. 6116-6122.8. B. Polevoda, F. Sherman. Methylation of proteins involved in translation. // Mol Microbiol.2007.
V. 65. P. 590-606.9. C.N. Chang, N. Chang. Methylation of the ribosomal proteins in Escherichia coli. Nature andstoichiometry of the methylated amino acids in 50S ribosomal proteins. // Biochemistry.1975. V. 14. P. 468-477.10. M.J. Dognin, B.
Wittmann-Liebold. Purification and primary structure determination of theN-terminal blocked protein, L11, from Escherichia coli ribosomes. // Eur J Biochem.1980. V. 112. P. 131-151.11. F.N. Chang, L.B. Cohen, I.J. Navickas, C.N. Chang. Purification and properties of aribosomal protein methylase from Eschericha coli Q13. // Biochemistry. 1975. V. 14. P.4994-4998.12. C. Colson, J. Lhoest, C.
Urlings. Genetics of ribosomal protein methylation in Escherichiacoli. III. Map position of two genes, prmA and prmB, governing methylation of proteinsL11 and L3. // Mol Gen Genet. 1979. V. 169. P. 245-250.10013. H. Demirci, S.T. Gregory, A.E. Dahlberg, G. Jogl. Recognition of ribosomal protein L11 bythe protein trimethyltransferase PrmA. // EMBO J. 2007.
V. 26. P. 567-577.14. H. Demirci, S.T. Gregory, A.E. Dahlberg, G. Jogl. Multiple-site trimethylation of ribosomalprotein L11 by the PrmA methyltransferase. // Structure. 2008. V. 16. P. 1059-1066.15. R.K. Agrawal, J. Linde, J. Sengupta, K.H. Nierhaus, J. Frank. Localization of L11 protein onthe ribosome and elucidation of its involvement in EF-G-dependent translocation. // JMol Biol.
2001. V. 311. P. 777-787.16. D.M. Cameron, J. Thompson, P.E. March, A.E. Dahlberg. Initiation factor IF2, thiostreptonand micrococcin prevent the binding of elongation factor G to the Escherichia coliribosome. // J Mol Biol. 2002. V. 319. P. 27-35.17. M. Valle, A. Zavialov, W. Li, S.M. Stagg, J. Sengupta, R.C. Nielsen, P.
Nissen, S.C. Harvey,M. Ehrenberg, J. Frank. Incorporation of aminoacyl-tRNA into the ribosome as seen bycryo-electron microscopy. // Nat Struct Mol Biol. 2003. V. 10. P. 1074-1074.18. A. Vanet, J.A. Plumbridge, M.-F. Guérin, J.-H. Alix. Ribosomal protein methylation inEscherichia coli: the gene prmA, encoding the ribosomal protein L11 methyltransferase,is dispensable. // Molecular Microbiology. 1994. V. 14.
P. 947-958.19. C. Colson. Genetics of ribosomal protein methylation in Escherichia coli. I. A mutantdeficient in methylation of protein L11. // Mol Gen Genet. 1977. V. 154. P. 167-173.20. J. Lhoest, C. Colson. Genetics of ribosomal protein methylation in Escherichia coli. II. Amutant lacking a new type of methylated amino acid, N5-methylglutamine, in protein L3.// Mol Gen Genet. 1977.
V. 154. P. 175-180.21. T.A. Muranova, A.V. Muranov, L.F. Markova, Y.A. Ovchinnikov. The primary structure ofribosomal protein L3 from Escherichia coli 70 S ribosomes. // FEBS Letters. 1978. V.96. P. 301-305.22. J. Lhoest, C. Colson. Cold-sensitive ribosome assembly in an Escherichia coli mutantlacking a single methyl group in ribosomal protein L3.
// Eur J Biochem. 1981. V. 121. P.33-37.23. V. Heurgue-Hamard, S. Champ, A. Engstrom, M. Ehrenberg, R.H. Buckingham. The hemKgene in Escherichia coli encodes the N(5)-glutamine methyltransferase that modifiespeptide release factors. // EMBO J. 2002. V. 21. P. 769-778.24. M. Kaczanowska, M. Ryden-Aulin. Ribosome biogenesis and the translation process inEscherichia coli.
// Microbiol Mol Biol Rev. 2007. V. 71. P. 477-494.25. R. Chen, U. Chen-Schmeisser. Isopeptide linkage between N-alpha-monomethylalanine andlysine in ribosomal protein S11 from Escherichia coli. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1977.V. 74. P. 4905-4908.10126. C.L. David, J. Keener, D.W. Aswad. Isoaspartate in ribosomal protein S11 of Escherichiacoli. // J Bacteriol. 1999. V. 181.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
