Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6 (1105555), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Раствор разделяли на аликвоты по 100 мкл,замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80˚С.3.2.5.2. Выделение суммарного рибосомного белкаБрали 150-200 оптических единиц рибосом в 200 мкл буфера. Добавляли 20 мкл(0,1 объёма) 1М ацетата магния и 440 мкл (2 объёма) ледяной уксусной кислоты,перемешивали при 0ºС в течение 45 мин. Центрифугировали при 10000 об/мин 30 мин при4ºС.
Переносили супернатант в новую пробирку, добавляли к нему 3,3 мл (5 объёмов)ацетона, инкубировали 3 ч при -20ºС. Полученный осадок осаждали центрифугированиемпри 10000 об/мин 30 мин при 4ºС, сливали супернатант и высушивали осадок. Затемресуспендировали осадок в 500 мкл буфера для суммарного рибосомного белкасодержащего 6 М мочевину и диализовали против этого же буфера. После этого ещё3 раза диализовали против буфера для суммарного рибосомного белка (без мочевины),центрифугировали при 5000 об/мин 5 мин, супернатант аликвотили.
Концентрацию белкаопределяли по поглощению при 230 нм [103].3.2.5.3. Белковый электрофорез в ПААГ в денатурирующих условияхСобирали камеру для заливки ПААГ Mini-Protean II фирмы Bio-Rad, заливалиразделяющий гель. После полимеризации разделяющего геля заливали концентрирующийгель,вкоторыйвставляли“гребенку”дляобразцов.Послеполимеризацииконцентрирующего геля наносили предварительно прогретые при 95ºС в течение 5 минобразцы (к образцам предварительно добавляли 2х буфер для нанесения на гель).Электрофорез проводили в буфере трис-глицин, сначала при 80 В, пока краситель недостигал границы концентрирующего и разделяющего гелей, затем при 130 В допрохождения бромфенолового синего до конца геля.После проведения электрофореза гель помещали в ванночку с раствором дляпрокрашивания белков и инкубировали 2–16 ч.
Затем гель отмывали водой с уксуснойкислотой до проявления белковых зон.3.2.5.4. ИммуноблоттингПроводили белковый электрофорез в 18% ПААГ в денатурирующих условиях.Замачивали мембрану PVDF в этиловом спирте 2 минуты, промывали 5 минут вдистиллированной воде, затем мембрану и гель замачивали 5-10 минут в буфере дляпереноса. Гель помещали на 3 листа фильтровальной бумаги Watman 3MM, смоченных вбуфере для переноса, накрывали мембраной, 3 листами фильтровальной бумаги Watman3MM, смоченных в буфере для переноса.
Перенос проводили при 100 мА 2 часа в буфере94для переноса. Далее мембрану блокировали в 5% растворе BSA в TBST (1мл/см2) втечение 12 часов, промывали TBST 4 раза по 5 минут.Далее для визуализации белков мембрану в течение 1 часа инкубировали спервичными антителами - анти-S6 (разведение 1:10000 в TBST). Мембрану промывалиТВST 3 раза по 10 минут и инкубировали в течение 1 часа со вторичными антителамипротив антител козы, коньюгированными с пероксидазой хрена (разведение 1:3000).Мембрану промывали TBST 3 раза по 10 минут.Окрашивание мембраны проводили с помощью “ECL+ kit” (GE Healthcare). Дляпроявления смешивали растворы А и В в соотношении 40:1, 0,5 мл полученной смесисмачивали мембрану, после чего раствор удаляли. Проявку осуществляли с помощьюкамеры BioRad.3.2.5.5. Двумерный дифференциальный гель-электрофорез5 мл клеточных культур центрифугировали при 4000 об/мин, дважды промывалиресуспендированием в 1 мл TBS и центрифугированием при 4000 об/мин. Избавлялись отостатков супернатанта и ресуспендировали осадки в 20 мкл 40% Chaps-NP40.
Кполученным суспензиям добавляли 10 мкл раствора смеси нуклеаз и лизировали клеткизаморозкой в жидком азоте – разморозкой при 37ºС (5 циклов). После этого пробиркиинкубироваливольду30 минут,добавляли70 мклбуферадляобразцаицентрифугировали при 12000 об/мин, избавляясь затем от осадка. В полученныхрастворах определяли концентрацию белка по методу Бредфорд [104].Отбирали аликвоты растворов, содержащие 100 мкг белка, доводили объёмыбуферомдляобразцадо40 мкл.Крастворамдобавляли1 мкл(400 пмоль)флуоресцентных красителей (Cy3 – к образцам из клеток дикого типа, Cy5 – к образцам изклеток ∆rimK). Инкубировали пробирки 30 минут во льду, после чего добавляли 1 мкл10 мМ лизина и инкубировали ещё 15 минут во льду.Заливали гели для изоэлектрофокусировки в трубочки с диаметром 1 мм.
Послеполимеризации гелей образцы из клеток дикого типа смешивали с соответствующимиобразцами из клеток ∆rimK, добавляли к смеси амфолиты BioRad до 1% и дитиотреитолдо 1%, наносили на гели и проводили изоэлектрофокусировку по следующей программе:линейный градиент напряжения от 50 В до 600 В, 6 часов, 700 В, 10 часов, 900 В, 2 часа.Заливали градиентные (8%-16%) денатурирующие ПААГ для второго направления.Останавливали изоэлектрофокусировку, извлекали гели из стеклянных трубочек иинкубировалигели30 минутвбуфередляуравновешивания.Наносилиизоэлектрофокусировочные гели на гели для второго направления и проводилиэлектрофорез при 250 В в течение 5 часов.
Сканировали гели на флуоресцентном сканере95Typhoon (Fuji). После этого гели замачивали в фиксаже минимум на 2 часа.Фиксированные гели 3 раза отмывали деионизованной водой и окрашивали серебром3.2.5.6. Окрашивание белковых ПААГ серебромВсе манипуляции проводили в растворах с деионизованной водой. Фиксированныйи промытый водой гель промывали 0,03% раствором тиосульфата натрия в течение2 минут. Затем отмывали гель водой 3 раза по 1 минуте и окрашивали раствором нитратасеребра 15-20 минут.
После двукратной 30-секундной отмывки водой от нитрата серебра кгелю добавляли проявитель и инкубировали в нём гель до полной проявки. Окрашиваниеостанавливали добавлением 10% уксусной кислоты. Затем сливали жидкость и промывалигель 3-4 раза водой.3.2.5.7. Идентификация белковых зон в ПААГВсе манипуляции проводили в растворах с хроматографически чистой водойCHROMASOLV, Panreac. Белковые зоны из окрашенных серебром гелей вырезалискальпелем, куски геля дважды промывали буфером для промывки в течение 20 минут.Затем куски геля обезвоживали в ацетонитриле в течение 5 минут и сушили на воздухе. Квысушенным кускам геля добавляли равный объём раствора трипсина и инкубировалипри 37ºС 4 часа, после чего добавляли равный объём 0,5% трифторуксусной кислоты.Образец наносили на подложку для MALDI, высушивали на воздухе и анализировали спомощью масс-спектрометра Ultraflex II (Bruker). Полученный масс-спектр анализировалив программе flexAnalysis 3.2, белки идентифицировали, используя программу Mascot 2.4.2и базу данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI).
MALDITOF анализ выполнялся д.х.н. Серебряковой М.В.3.2.5.8. Мечение флуоресцентной меткой вновь синтезированных белков.Индивидуальную колонию помещали в среду M9, в которые были добавлены всеаминокислоты (40 мг/л каждая) и растили ночь при 37°C. Полученную ночную культуруразбавляли в 50 раз в 10 мл среды M9 с аминокислотами. В определённый момент(указано в обсуждении результатов) к среде с клетками добавляли гомопропаргилглицин(доконцентрации25 мкM,Invitrogen).Встраиваниегомопропаргилглицинаостанавливали скручиванием клеток через 10 минут (через час, в случае добавлениягомопропаргилглицина к клеточной культуре в стационарной фазе).
Клетки дваждыпромывали 0,9% NaCl и суспендировали в буфере для лизиса. После инкубирования втечение 20 минут на льду раствор замораживали в жидком азоте и медленноразмораживали. Затем клетки разрушали обработкой ультразвуком и центрифугировали.Супернатант собирали и хранили при -20°C.
Для мечения использовали набор Click-iT96(Invitrogen) и метку Cy5. Помеченные образцы разделяли в одномерном денатурирующемПААГ. Детекцию флуоресценции осуществляли при помощи сканера флуоресценции(Fuji).3.2.5.9. Выделение рекомбинантного фермента RimK с помощью Ni-NTA агарозыКлетки штамма BL21 (DE3) были трансформированы плазмидой pET-33-rimK ивысеяны на чашку Петри с канамицином. Одной колонией клеток инокулировали 4 млсреды LB c канамицином. Культуру клеток растили при 37ºС в течение 16 ч приинтенсивном перемешивании.
Полученную ночную культуру переносили в колбу с 400 млLB, содержащей канамицин, выращивали при 37ºС и перемешивании 180 об/мин доA600 0,3. Затем добавляли 400 мкл 1М водного раствора ИПТГ, растили еще 2 ч. Культуруклеток охлаждали до 4˚С затем клетки осаждали центрифугированием в роторе JA-10 при5000 об/мин 4ºС в течение 10 мин. Сливали супернатант, осадок клеток ресуспендировалив 20 мл буфера для промывки клеток. Суспензию центрифугировали в роторе JA-10 при5000 об/мин 4ºС в течение 10 мин. Затем ещё раз промывали 20 мл буфера ицентрифугировали. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл буфера для лизиса ипроводили разрушение клеток ультразвуком 5 раз по 15 сек с перерывами по 45 сек.Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 15000 об/мин 30 мин при 4ºС.Отбирали супернатант и добавляли к нему 1 мл 50% суспензии Ni-NTA агарозы (Qiagen).Медленно перемешивали в течение 30 мин на качалке при 4оС.
Осаждали смолуцентрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин. Промывали 5 раз по 10 мл буферадля промывки смолы в течение 15 мин. После каждой промывки, осадок Ni-NTA агарозыотделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин. Для элюции белка ксмоле добавляли 5 мл буфера для элюции, медленно перемешивали в течение 15 мин.Осаждали смолу центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин, отбиралисупернатант.Проводили диализ отобранного супернатанта.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
