Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6 (1105555), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Адаптация кизменению окружающей среды необходима для выживания бактериальной культуры.Одной из важнейших составляющих этой адаптации является прекращение процессатрансляции, поскольку синтез белка требует огромных затрат ресурсов. Именно поэтомуолигоглутамилирование рибосомного белка S6 происходит в стационарной фазе роста, чтовызывает подавление трансляции. Модификация белка S6 важна для выживания клеток вусловиях дефицита ресурсов. Отсутствие модификации S6 приводит к нарушениюнормального ингибирования трансляции в стационарной фазе, что приводит к истощениюклеточных ресурсов. Возможно, имено поэтому выживаемость клеток ∆rimK встационарной фазе ниже, чем клеток дикого типа, и они проигрывают последним вконкурентной борьбе.Мыпоказали,чтодляингибированиятрансляциирибосомсолигоглутамилированным белком S6 никаких дополнительных факторов не требуется.Таким образом, модификация белка S6 сама по себе ингибирует активность рибосомы встационарной фазе.
С-конец рибосомного белка S6 не разрешён на имеющихсятрёхмерных моделях бактериальной рибосомы, но его примерное положение впространстве понятно. Белок S6 располагается на платформе малой субчастицы рибосомыблизко к месту связывания 5’-нетранслируемой области мРНК в процессе инициациитрансляции.Закодированныйв геномной ДНКС-концевой участокбелка S6,DDAEAGDSEE, сам по себе достаточно кислый, причём два концевых остаткаглутаминовой кислоты уже содержатся в нём. Суммарный заряд С-концевого участка вфизиологическихусловияхравен-6.Посттрансляционноедобавлениеостатковглутаминовой кислоты приводит к дополнительному увеличению отрицательного заряда.Одним из наиболее вероятных объяснений ингибирования трансляции может бытьэлектростатическое отталкивание отрицательно заряженной мРНК от её сайта связыванияна рибосоме (рис.
2.24).78Рисунок 2.24. Пространственная близость С-конца белка S6 c местом посадки мРНКПереход из стационарной фазы в состояние активного роста бактериальнойкультуры имеет свои подводные камни. Активно метаболизирующие и делящиеся клеткистановятся мишенью для многочисленных антибиотиков. Эволюцией придуманастратегия защиты бактериальной культуры, основанная на минимизации рисков.
Дляэтого в растущей популяции всегда присутствуют «спящие» клетки, в которых сведён кминимуму метаболизм, и которым проще пережить неблагоприятные условия, вчастности, действие антибиотиков. Такое разделение популяции на спящие и делящиесяклетки позволяет увеличить для бактериальной культуры шанс выжить в постоянноменяющихся внешних условиях. Мы показали, что этот механизм защиты нарушен вклетках ∆rimK. Популяция клеток, в которых не происходит олигоглутамилированиябелка S6, при попадании в благоприятные условия не разделяется на субпопуляцииспящих и делящихся клеток, все клетки начинают активно синтезировать белок.Возможно,потомучтоунихнарушенмеханизмингибированиятрансляции.Олигоглутамилирование белка S6 важно для образования спящих клеток, а значит, дляреализации стратегии минимизации рисков в бактериальной культуре.Спящие бактериальные клетки, не чувствительные к антибиотикам, являютсясерьёзной проблемой в терапии инфекционных болезней.
Фермент RimK, которыйучаствует в подавлении биосинтеза белка в клетке, может быть перспективной мишенью79для направленного создания ингибиторов. Этот подход может быть полезен в дальнейшемразвитии антибактериальной терапии.Для эукариот описано множество посттрансляционных модификаций белков (восновном,фосфорилирования),которыеосуществляютсяврегуляторныхцелях.Например, фосфорилирование эукариотического рибосомного белка S6, являющеесяследствием запуска mTOR-пути, приводит к активации трансляции и оказывает влияниена многие клеточные процессы, такие как пролиферация и гомеостаз глюкозы в клетке[96].
Для прокариотических рибосомных белков подобной регуляции трансляциипосредством посттрансляционной модификации до сих пор не было описано. Известенпример регулируемой модификации рибосомного белка – ацетилирование белка L12,которое происходит в стационарной фазе роста, но функция этой модификации остаётсянеизвестной [50]. Таким образом, олигоглутамилирование рибосомного белка S6 – перваяописанная регулируемая посттрансляционная модификация бактериального рибосомногобелка, являющаяся частью системы регуляции трансляции.803.
Материалы и методы3.1. Реактивы и биопрепараты3.1.1. РеактивыВработебылииспользованыследующиереактивы:дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (ICN Biomedicals Inc., США); 1,4-дитиотреитол (DTT),хлорамфеникол, арабиноза, хлорид марганца, гидроксид калия, бромфеноловый синий,ксиленцианол,тиомочевинануклеозидтрифосфаты,нитратфолиноваясеребра,кислота,формальдегид,Chapsаминокислоты,(Sigma-Aldrich,CША);2-меркаптоэтанол, N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), акриламид, изопропил-1тио-β-D-галактопиранозид (ИПТГ), сахароза, персульфат аммония, хлорид натрия, хлоридкалия, хлорид аммония, ацетат аммония, борная кислота, трис(оксиметил)аминометан(Tris), агар, агароза глюкоза, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат калия, Tween 20, nonidetP40, (Хеликон, Россия); додецилсульфат натрия, хлорид магния, хлорид кальция, ацетатмагния, сульфат магния, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), глицерин, ацетон (Merck,Германия); этанол (Ферейн, Россия); N,N’-метиленбисакриламид, мочевина, N-2гидроксиэтилпиперазин-N′-2-этансульфоновая кислота (HEPES), глицин, дрожжевойэкстракт, бакто-триптон, диметилсульфоксид (ДМСО), канамицин, ампициллин, бычийсывороточный альбумин (БСА) (Amresco, США); Кумасси R250, глутамат калия,ацетонинтил, гидрокарбонат аммония (Fluca); соляная кислота, (Химмед, Россия);ускусная кислота (Экрос, Россия); Triton X-100 (Serva, Германия); имидазол (MPBiomedicals, Франция) карбонат натрия, тиосульфат натрия (Panreac, Испания) амфолиты(Bio-Rad, США); Ni-NTA агароза (Qiagen); U-14C глутаминовая кислота (Amersham,США),гомопропаргилглицин(Invitrogen,США),гидроксиднатрия(Chemapol,Чехословакия).В работе использовали ферменты фирм: MBI Fermentas (Литва), Promega (США),New England Biolabs (США), Roche (Франция), Helicon (Россия), СибЭнзим (Россия).Олигонуклеотиды фирм ДНК-Синтез (Россия), Евроген (Россия) и Синтол (Россия).3.1.2.
Буферы и растворыВ работе были использованы следующие буферы и растворы:Микробиологические среды:LB: 1% (w/v) бактотриптона, 0,5% (w/v) дрожжевого экстракта, 1% (w/v) NaCl.Агаризованные среды: LB c добавлением 1,5% бактоагара.81SOB: 2% (w/v) бактотриптона, 0,55% (w/v) дрожжевого экстракта, 10 мМ NaCl,10 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4.SOC: 2% (w/v) бактотриптона, 0,55% (w/v) дрожжевого экстракта, 10 мМ NaCl,10 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза.M9: 11,4 г/л Na2HPO4·7H2O, 3 г/л KH2PO4, 0,5 г/л NaCl, 1 г/л NH4Cl, 2 мМ MgSO4,0,1 мМ CaCl2, 0,2% глюкоза.Буфер для приготовления компетентных клеток TB: 10 мМ PIPES, 15 мМCaCl2, 250 мМ KCl, 55 мМ MnCl2, рН 6,7.Растворы для белкового электрофореза и иммуноблоттинга:Буфер трис-глицин: 25 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 250 мМ глицин, 0,1% SDS.Разделяющий гель: 15% полиакриламид в смеси с 1/30 бисакриламида, 0,375 МTris-HCl pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% персульфат аммония, 0,03% ТЕМЕД.Концентрирующий гель: 5% полиакриламид в смеси с 1/30 бисакриламида,0.125 М Tris-HCl pH 6,8, 0.1% SDS, 0,1% персульфат аммония, 0,03% ТЕМЕД.Буфер для нанесения образцов на полиакриламидный гель: 50 мМ Tris-HCl(pH 6.8), 100 мМ DTT, 2% SDS 0,1% бромфеноловый голубой, 10% глицерин.Раствор для прокрашивания белковых гелей: 0,25% красителя Кумасси R-250,45% этанола и 10% уксусной кислоты.TBST: 50 мМ Tris HCl, pH 7,6; 150 мМ NaCl; 0,05% Tween 20.Растворы для двумерного белкового электрофореза:TBS: 50 мМ Tris HCl pH 7,6; 150 мМ NaCl.Chaps/NP40: 30% Chaps; 10% Nonidet P-40.Смесь нуклеаз: 0,08 мг/мл рибонуклеазы А, 1 u/мкл дезоксирибонуклеаза I.Буфер для образца: 30 мМ Tris HCl, pH 8,5; 7М мочевина; 2М тиомочевина; 3%Chaps; 1% Nonidet P-40.Раствор Бредфорд: 0,01% кумасси G-250; 5% этиловый спирт; 8,5% фосфорнойкислоты.Гельдляизоэлектрофокусировки:4%полиакриламидвсмесис0,8/29 бисакриламида; 8М мочевина; 2% амфолиты; 1,8% Chaps, 0,6% Nonidet P-40.8% ПААГ: 8% полиакриламид в смеси с 1/30 бисакриламида; 0,375 М Tris-HCl,pH 8,8; 0,1% SDS; 0,1% персульфат аммония; 0,02% ТЕМЕД.16% ПААГ: 16% полиакриламид в смеси с 1/30 бисакриламида; 0,375 М Tris-HCl,pH 8,8; 0,1% SDS; 0,025% персульфат аммония; 0,02% ТЕМЕД.Буфер для уравновешивания: 150 мМ Tris-HCl, pH 6,8; 8М мочевина; 2,5% SDS;50% глицерин.82Фиксаж: 20% этанол, 10% уксусная кислота.Растворы для окрашивания белковых гелей серебром:Раствор тиосульфата натрия: 0,03% Na2S2O3.Раствор нитрата серебра: 0,1% AgNO3; 0,04% формальдегид.Проявитель: 4% Na2CO3; 0,0006% Na2S2O3; 0,04% формальдегид.Раствор для остановки окрашивания: 10% уксусная кислота.Растворы для подготовки образцов белков к MALDI:Буфер для промывки: 50 мМ NH4HCO3; 40% ацетонитрил.Раствор для трипсинолиза: 10 нг/мкл трипсин; 100 мМ NH4HCO3.Раствор для окончания трипсинолиза и элюции пептидов из геля: 0,5%трифторуксусная кислота.Растворы для электрофореза в агарозном геле:TBE: 100 мМ Tris-HCl; 100 мМ H3BO3; 2 мМ EDTA pH 8,3.Агарозные гели: 1-2% агарозы в буфере TBE, 1 мкг/мл этидий-бромид.Буфер для нанесения образцов в агарозный гель: 10 мМ Tris-HCl (pH 7,6),0,03% бромфенолового синего, 0,03% ксиленцианола, 60 мМ ЭДТА, 60% глицерин,TBE.Буферы для выделения рибосом, рибосомных белков:Связывающий буфер (для выделения рибосом): 20 мМ Hepes-KOH (рН 7.5);10 мМ Mg(OAc)2; 100 мМ NH4OAc; 2 мМ дитиотреитол.Диссоциирующий буфер (для выделения рибосом): 20 мМ Hepes-KOH (рН 7.5);1 мМ Mg(OAc)2; 100 мМ NH4OAc; 2 мМ дитиотреитол.Буфердлясуммарногорибосомногобелка:20 мМTris-HCl(pH 7,4),4 мМ Mg(OAc)2, 400 мМ NH4Cl, 0,2 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанол.Буферы для выделения белка с помощью Ni-NTA агарозы:Буфер для промывки клеток: 10 мМ Tris-HCl (рН 7,8), 1 мМ MgCl2, 100 мМNH4Cl.Буфер для лизиса: 10 мМ Tris-HCl (рН 7,8), 1 мМ MgCl2, 100 мМ NH4Cl,5 мМ имидазол, 0,1% лизоцим.Буфер для промывки смолы: 10 мМ Tris-HCl (рН 7,8), 1 мМ MgCl2,100 мМ NH4Cl, 40 мМ имидазол.Буфер для элюции: 10 мМ Tris-HCl (рН 7,8), 1 мМ MgCl2, 100 мМ NH4Cl,400 мМ имидазол, 0,1% Тритон Х100, 2 мМ дитиотреитол.Буфер для диализа: 10 мМ Tris-HCl (рН 7,8), 1 мМ MgCl2, 100 мМ NH4Cl,0,1% Тритон Х100, 2 мМ дитиотреитол.83Растворы для in vitro трансляции:РастворА:87,5 мМTris-CH3COOH(pH8);0,5 мМглутаматкалия;75 мМ CH3COONH4; 5 мМ DTT; 20 мМ (CH3COO)2Mg; 1,25 мМ аминокислоты;5 мМ АТФ;1,25 мМ ГТФ;1,25 мМ ЦТФ;1,25 мМ УТФ;фосфоенолпируват;0,25 мг/мл тРНК; 50 мкг/мл фолиновая кислота.Раствор рибонуклеазы А: 1 мкг/мл рибонуклеаза А.Буфер для проточной цитометрии:PBS: 1,57мМ KH2PO4; 5,2 мМ Na2HPO4; 150 мМ NaCl.Буферы для работы с ДНК:Буферы для эндонуклеаз рестрикции фирм: MBI Fermentas (Литва), Promega(США), New England Biolabs (Англия), Roche (Франция), СибЭнзим (Россия);буфер для ДНК лигазы бактериофага T4 фирмы MBI Fermentas (Литва).3.1.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
