Диссертация (1105109)
Текст из файла
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТим. М.В. ЛОМОНОСОВАФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописиКулешова Анна АлександровнаФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАНОМАРКЕРОВСЕМЕЙСТВА ФЛУОРЕСЦЕИНА В РАСТВОРАХ СЫВОРОТОЧНЫХАЛЬБУМИНОВСпециальность:01.04.05 – оптика03.01.02 – биофизикаДИССЕРТАЦИЯна соискание ученой степени кандидата физико-математических наукНаучные руководители:доктор физико-математических наук,профессор А. М. Салецкийкандидат физико-математических наук,старший преподаватель И.М.
ВласоваМосква – 2016ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ……………….………………………………………………….…..4ГЛАВА I. СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЛУОРЕСЦЕТНЫХ КРАСИТЕЛЕЙ СБИОЛОГИЧЕСКИМИ ОБЪЕКТАМИ (ПО ДАННЫМЛИТЕРАТУРЫ)….……………………………………………………………..12§1.1. Физические основы флуоресцентной спектроскопии...….….……….....12§1.2. Элементы теории тушения флуоресценции.………………..………........14§1.3.
Спектры поглощения и молекулярная ассоциация красителей врастворах ………………………………………………………………………...15§1.4. Флуоресцентные наномаркеры семейства флуоресцеина………..….….19§1.5. Сывороточные альбумины (человеческий, бычий)………...……….…..21§1.6.Применениефлуоресцентныхнаномаркероввисследованияхбиологического материала……………………………………………………....23ГЛАВА II. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА ………………………….…..31§2.1. Приготовление растворов наномаркеров семейства флуоресцеина дляизучения их флуоресцентных характеристик в растворах альбуминов(бычьего, человеческого)……………………………………………….……….31§2.2.
Измерение спектров поглощения и определение степени молекулярнойассоциации и угла между молекулами в ассоциации …………….…..............31§2.3. Измерение спектрально - люминесцентных характеристик растворовнаномаркеров.………....................................................................………...…….32ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ …………………………………………....……...35§3.1.Спектральныехарактеристикифлуоресценциинаномаркеровврастворах альбуминов …....…………………………………………………......35§3.2.Флуоресцентныефлуоресцеинавхарактеристикирастворахальбуминов.наномаркеровТушениесемействафлуоресценциинаномаркеров........................................…………………………………….…....43§3.3.
Концентрационное тушение флуоресценции наномаркеров семействафлуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов ......…………………..522§3.4. Молекулярная ассоциация наномаркеров семейства флуоресцеина вбелковых растворах………....…………………………………………………...60§3.5. Вращательная диффузия наномаркеров семейства флуоресцеина врастворах белка......................................................................................................86ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ……………………..…….........98ЛИТЕРАТУРА………………………………………………………………...1053ВВЕДЕНИЕАктуальность и степень разработанности темыОдной из важнейших задач современной физики является изучениебиологического материала. С помощью спектроскопических методовпроводятся активные исследования по реализации быстрого мониторингаизменения состояния клеток, белков, тканей и остальных биологическихобъектов, осуществляемые при небольших количествах исследуемогообразца.
Метод флуоресцентных наномаркеров (красителей) с каждым годомвсё активнее применяется в физике, медицине, фармакологии и биологии, таккак позволяет получать информацию об исследуемом материале заминимальныесрокибезинвазивноговоздействия.Спомощьюфлуоресцентной спектроскопии исследуют, в частности, как нативнуюструктуру белков (сывороточных альбуминов), так и процессы их обратимойи необратимой денатураций, различные модификации их структуры приизменении окружающей внешней среды.Сывороточные альбумины человека (САЧ) и быка (БСА) являютсяосновными белками плазмы крови, в плазме крови человека значение егоконцентрации около 50 г/л. Сывороточный альбумин синтезируется в печении секретируется её клетками в кровь.
Размеры молекул альбумина невелики,но концентрация высока, и он определяет коллоидно-осмотическое давлениев плазме. Сывороточные белки (человеческий и бычий) имеют похожуюструктуру, так как принадлежат одному гомологическому семейству белков.Молекулы сывороточных альбуминов состоят из цепочки аминокислотныхостатков: человеческий насчитывает 585 аминокислотных остатков, бычий –582. Эти небольшие глобулярные белки обладают схожим значениемизоэлектрической точки pI (для сывороточного альбумина человека еёзначение составляет 4,7; для бычьего – 4,9). При соответствующих pH вовторичнойструктуре оба белкаимеютприблизительноодинаковыесодержания регулярных структур.4Одной из основных функций данных белков является транспортфизиологических метаболитов, переносимых кровью, чему способствуетбольшая площадь поверхности множества молекул альбумина.
Сам механизмсвязыванияобширногокругалигандовопределяетсяналичиемусывороточных альбуминов специфических участков - связывающих центров.Естьцентры,отвечающиезасвязываниясионамиметаллов,сдлинноцепочечными жирными кислотами, с лигандами со свободной SHгруппой.ЗначительныйинтереспредставляютIиIIцентры(неспецифические лекарственные центры связывания), присоединяющиемалые органические молекулы.Большую роль в изучении физико – химических свойств связывающихцентровбелковиграетметодфлуоресцентныхнаномаркеров(люминесцентных зондов), чрезвычайно чувствительных к малейшимизменениям окружающей белка среды.
Флуоресцентная спектроскопияпозволяет анализировать данные подобных трансформаций, сигналов иизменений. На основе которых появляется возможность моделировать каккартинкуконформационногоизмененияструктурыбелков,такнепосредственно и сам механизм взаимодействия сывороточных альбуминовс лекарственными препаратами.Цели и задачи работыЦель настоящей работы заключалась в исследовании спектральнофлуоресцентных,спектрально-поляризационныхиабсорбционныххарактеристик наномаркеров семейства флуоресцеина (Ф, Э, Эр и БР) врастворах САЧ и БСА для различных pH среды и определении параметровповедениянаномаркеров,связанныхсбелками.Всоответствииспоставленной целью в работе были изучены следующие основные задачи.1. Измерение спектрально-флуоресцентных характеристик наномаркеровв растворах сывороточных альбуминов при различных концентрацияхи значениях pH.
Анализ изменений этих характеристик в растворахбелков и установление их природы.52. Проведение анализа процессов тушения флуоресценции наномаркеровфлуоресцеина и его галоген – производных в растворах САЧ и БСАпри разных pH и определение параметров этих процессов: константысвязывания с белками и коэффициента кооперативности.3. ИсследованиефлуоресцеинаспектроввпоглощениярастворахСАЧинаномаркеровБСАприихсемействаразличныхконцентрациях и значениях pH. Анализ процессов молекулярнойассоциации молекул красителей. Определение эффективности такихпроцессов, структуры ассоциатов и влияния белков на процессыкомплексообразования.4. Измерение спектров поляризованной флуоресценции наномаркеров.Определение параметров вращательной диффузии наномаркеров врастворах САЧ и БСА при варьировании pH.Методы и методология исследованияОсновнымметодом,используемымвработе,являетсяметодфлуоресцентной спектроскопии, позволяющий получить информацию овзаимодействиифлуоресцентныхкрасителейссывороточнымиальбуминами.
Измерения осуществлялись при комнатной температуре приразличных значениях pH растворов. Для получения спектров флуоресценциииспектровпоглощениябылииспользованыспектрометриспектрофлуориметр фирмы Perkin Elmer. Анализ полученных спектров иданных осуществлялись с помощью современных методов и программ пообработке спектров, использующих математические алгоритмы.Основные положения, выносимые на защиту1. Длинноволновое смещение спектров флуоресценции наномаркеровсемейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов связанос изменением дипольного момента молекул при возбуждении.Замещение атомами брома, йода, хлора в структуре флуоресцеинавызывает в ряду Ф → Э → Эр → БР изменение конфигурации и жесткости6ядерной системы и, как следствие, увеличение дипольного моментамолекул при возбуждении.2.
Увеличениезначениястепенианизотропиифлуоресценциинаномаркеров семейства флуоресцеина в растворах САЧ или БСАобусловленосвязыванием наномаркеров с белками, вызывающимуменьшение вращательной диффузии для галоген - производныхфлуоресцеина более чем на порядок.3. Уменьшение вращательной диффузии для 3,5 < pH < 8,0, как вбуферных растворах, так и в растворах САЧ или БСА в ряду Ф → Э →→ Эр → БР связано с увеличением электроотрицательности радикаловбоковых групп молекул в том же порядке.4. Одинаковый характер спектрально-флуоресцентных зависимостей изакономерностей для констант связывания наномаркеров семействафлуоресцеина с САЧ и БСА от значения pH объясняется тем фактом,что зависимость зарядов обоих альбуминов от pH имеет практическиидентичный характер, с той лишь разницей, что БСА положительнозаряжен при pH< 4,9 и отрицательно заряжен при pH> 4,9, а САЧ вцелом положительно заряжен при pH< 4,7 и отрицательно заряжен приpH> 4,7.5.
Уменьшение степени молекулярной ассоциации наномаркеров иизменение структуры ассоциатов в растворах САЧ и БСА связано суменьшением их степени сродства к молекулам зондов (коэффициенткооперативности n < 1). Поэтому молекулы наномаркеров связываютсятолько с одним связывающим центром сывороточных альбуминов и кнему уже не могут присоединяться другие молекулы красителя,которые не могут также присоединяться к остальным центрам. Врезультате в среде, окружающей белок, концентрация молекулкрасителяуменьшаетсяинаблюдаетсяуменьшениестепениассоциации.76. Нелинейный характер концентрационного тушения флуоресценцииFнаномаркеров (зависимостей Штерна – Фолмера 0 − 1Fот[Q ] )обусловлен наличием нескольких типов механизмов (ковалентный,ионный) образования комплекса флуоресцентный краситель – белок.Достоверность и апробация результатовВоспроизводимостьрезультатов,ихэкспериментальным исследованиям и даннымполученныхипроанализированныхсоответствиеизвестнымобеспечивает достоверностьданных.Пополученнымвдиссертационной работе результатам была опубликованы 23 печатныеработы, из которых 7 – статьи в рецензируемых журналах, входящие в составперечняВАК.Такжерезультатыпредставленынароссийскихимеждународных конференциях: “Week of Doctoral Students 2013”(WDS 2013),Прага, Чешская Республика (4-7 июня, 2013); XVII, XVIII, XIX , XX и XXIвсероссийские конференции «Структура и динамика молекулярных систем»,Яльчик, Россия (28 июня – 2 июля, 2010; 4-9 июля, 2011; 25-30 июня, 2012;24-29 июня, 2013; 22-27 июня, 2014); XVII и XVIII международныеконференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальнымнаукам «Ломоносов», Москва, Россия (12-15 апреля, 2010; 11-15 апреля,2011); VII, VIII международные конференции «Фундаментальные проблемыоптики» Санкт-Петербург, Россия (15-19 октября, 2012; 20-24 октября, 2014);VIII международная конференция молодых ученых и специалистов “Оптика2013” Санкт-Петербург, Россия (14 – 18 октября, 2013); V и VI Троицкиеконференции «Медицинская физика и инновации в медицине», Троицк,Россия (4-8 июня, 2012; 2-6 июня, 2014).Научная новизнаНаучная новизна данной работы определяется выбором комплексабиологическихобъектов(бычьегосывороточногосывороточногоальбуминачеловека)иальбуминафлуоресцентныхикрасителейсемейства флуоресцеина (флуоресцеина, эозина, эритрозина и бенгальского8розового), что позволяет сравнить полученные результаты для двухразличных белков, понять, насколько будут отличаться данные приэкспериментальнойработесживотнымсывороточнымбелкомичеловеческим, и определить какие факторы будут оказывать влияние примоделировании связывания биологического материала с наномаркерами.Данный выбор позволил получить ряд важных результатов.1.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
