Автореферат (1105108)
Текст из файла
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТим. М.В.ЛомоносоваФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописиКулешова Анна АлександровнаФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАНОМАРКЕРОВСЕМЕЙСТВА ФЛУОРЕСЦЕИНА В РАСТВОРАХСЫВОРОТОЧНЫХ АЛЬБУМИНОВСпециальность: 01.04.05 – оптикаСпециальность: 03.01.02 – биофизикаАвторефератдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико – математических наукМосква - 2016РаботавыполненанакафедреобщейфизикифизическогофакультетаФедеральногогосударственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московскийгосударственный университет имени М.
В. Ломоносова»Научные руководители:Салецкий Александр Михайлович, доктор физикоматематических наук, профессорВласоваИринаМихайловна,кандидатфизикоматематических наук, старший преподаватель––Официальные оппоненты:Ведущая организация:Горелик Владимир Семенович, доктор физико-математическихнаук, профессор, Федеральное государственное бюджетноеучреждение науки Физический институт им.
П.Н.ЛебедеваРоссийской академии наук, заведующий лабораторией.Мельников Геннадий Васильевич, доктор химических наук,профессор,Федеральноегосударственноебюджетноеобразовательное учреждение высшего образования Саратовскийгосударственный технический университет имени Гагарина Ю.А.,профессор кафедры физикиФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования«Оренбургский государственный университет»Защита диссертации состоится « »2016 года вчасов на заседании диссертационногосовета Д.501.001.67 на физическом факультете Московского государственного университета имениМ.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, дом 1, строение 2, физическийфакультет, аудитория ЦФА.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственногоуниверситета имени М.В.
Ломоносова.Автореферат разослан «____» ______________2016 года.Ученый секретарьДиссертационного совета Д 501.001.67к.ф.-м.н., доцентКоролев А.Ф.2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность работыОдной из важнейших задач современной физики является изучение биологическогоматериала. С помощью спектроскопических методов проводятся активные исследования пореализации быстрого мониторинга изменения состояния клеток, белков, тканей и другихбиологических объектов, осуществляемые при небольших количествах исследуемогообразца.
Метод флуоресцентных наномаркеров (красителей) с каждым годом всё активнееприменяется в физике, медицине, фармакологии и биологии, так как позволяет получатьинформацию об исследуемом материале за минимальные сроки без инвазивноговоздействия. С помощью флуоресцентной спектроскопии исследуют, в частности, какнативную структуру белков (сывороточных альбуминов), так и процессы их обратимой инеобратимой денатураций, различные модификации их структуры при измененииокружающей внешней среды.Сывороточные альбумины человека (САЧ) и быка (БСА) являются основнымибелками плазмы крови, а именно составляют около 70% от всех белков, содержащихся вплазме крови.
Сывороточный альбумин синтезируется в печени и секретируется её клеткамив кровь. Размеры молекул альбумина невелики, но концентрация высока, и он определяетколлоидно-осмотическое давление в плазме. Сывороточные белки (человеческий и бычий)имеют похожую структуру, так как принадлежат одному гомологическому семейству белков.Молекулы сывороточных альбуминов состоят из цепочки аминокислотных остатков:человеческий насчитывает 585 аминокислотных остатков, бычий – 582. Эти небольшиеглобулярные белки обладают схожим значением изоэлектрической точки pI (для САЧ еёзначение составляет 4,7; для БСА – 4,9). При соответствующих pH во вторичной структуреоба белка имеют приблизительно одинаковые содержания регулярных структур.Одной из основных функций данных белков является транспорт физиологическихметаболитов, переносимых кровью, чему способствует большая площадь поверхностимножества молекул альбумина.
Сам механизм связывания обширного круга лигандовопределяетсяналичиемусывороточныхальбуминовспецифическихучастков-связывающих центров. Есть центры, отвечающие за связывания с ионами металлов, сдлинноцепочечными жирными кислотами, с лигандами со свободной SH-группой.Значительный интерес представляют I и II центры (неспецифические лекарственные центрысвязывания), присоединяющие малые органические молекулы.Большую роль в изучении физико – химических свойств связывающих центровбелков играет метод флуоресцентных наномаркеров (зондов), чрезвычайно чувствительных к3малейшим изменениям окружающей белка среды. Флуоресцентная спектроскопия позволяетанализироватьданныеподобныхтрансформацийиизменений.Повышениеинформативности спектральных методов (поглощения и флуоресценции) возможно за счетприменения ряда красителей, физико-химические свойства которых, влияющие навзаимодействие их молекул с белками, изменяются с некоторым шагом.
К такому рядукрасителей можно отнести красители семейства флуоресцеина. В данном ряду атом водородау флуоресцеина (Ф) заменяется галогеном: бромом у эозина (Э), йодом у эритрозина (Эр),хлором и йодом у бенгальского розового (БР). При этом ионы Ф диссоциированы в основномна карбоксильной группе, а для галоген-замещенных производных – на гидроксильной.Кроме того, эффект тяжелого атома является основной причиной изменения квантовыхвыходов флуоресценции и фосфоресценции, поляризации флуоресценции и среднеговремени жизни возбужденного состояния молекул.Цельдиссертационнойфлуоресцентных,работызаключаласьспектрально-поляризационныхивисследованииабсорбционныхспектральнохарактеристикнаномаркеров семейства флуоресцеина (Ф, Э, Эр и БР) в растворах САЧ и БСА дляразличных pH среды и определении параметров поведения наномаркеров, связанных сбелками.
В соответствии с поставленной целью в работе были изучены следующие основныезадачи.1. Измерение спектрально-флуоресцентных характеристик наномаркеров в растворахсывороточных альбуминов при различных концентрациях и значениях pH. Анализизменений этих характеристик в растворах белков и установление их природы.2. Проведение анализа процессов тушения флуоресценции наномаркеров флуоресцеинаи его галоген – производных в растворах САЧ и БСА при разных pH и определениепараметров этих процессов: константы связывания с белками и коэффициентакооперативности.3. Исследование спектров поглощения наномаркеров семейства флуоресцеина врастворах САЧ и БСА при их различных концентрациях и значениях pH. Анализпроцессовмолекулярнойассоциациимолекулкрасителей.Определениеэффективности таких процессов, структуры ассоциатов и влияния белков на процессыкомплексообразования.4.
Измерение спектров поляризованной флуоресценции наномаркеров. Определениепараметров вращательной диффузии наномаркеров в растворах САЧ и БСА приварьировании pH.4Научная новизна работы1. Установлено, что для всех исследованных красителей в растворах, содержащихальбумины, значения интенсивности в максимумах спектров флуоресценции,значительно меньше аналогичных значений для буферных растворов этих красителей.С увеличением значения pH тушение флуоресценции производных флуоресцеина (Э,Эр, БР) под действием белков уменьшается. Вид зависимости ∆I(pH) для Ф несовпадает с аналогичной зависимостью для его галоген – производных для низкихзначений pH (рН < 5,0).2. Установлена независимость степени анизотропии флуоресценции молекул галогенпроизводных флуоресцеина от pH среды.3. Определеныкоэффициентывращательнойдиффузиифлуоресцеина,эозина,эритрозина и бенгальского розового и установлено их уменьшение в растворах САЧ иБСА в широком диапазоне значений pH.4.
Показано, что при взаимодействии с сывороточными альбуминами измененияспектрально-флуоресцентных характеристик галоген-производных флуоресцеина (Э,Эр, БР) имеют схожие закономерности и отличаются от характеристик самогофлуоресцеина.5. Установлено уменьшение степени ассоциации красителей семейства флуоресцеина врастворах белков по сравнению с буферными растворами, сопровождающеесяизменением структуры ассоциатов.6. Обнаружено, что при увеличении значения электроотрицательности боковых атомоврадикалов в молекулах красителей семейства флуоресцеина их связывание ссывороточнымиальбуминамиуменьшаетсявобластиотpIбелковдофизиологического pH = 7,4.7. Для наномаркеров семейства флуоресцеина установлено уменьшение вращательнойдиффузии и увеличение времени вращательной релаксации в растворах САЧ и БСАпо сравнению с их буферными растворами.Практическая значимость работы:Полученные в диссертационной работе данные по взаимодействию наномаркеровсемейства флуоресцеина с сывороточными альбуминами при различных значениях pHимеют существенное значение для понимания и моделирования механизма связываниянаномаркеров с белком и дают информацию о влиянии окружающей биологический объект ифлуоресцентный краситель среды на процесс их взаимодействия.Результаты об эффективности связывания флуоресцентного красителя с сывороточнымиальбуминами позволяют получить модель взаимодействия белков с лекарственными5препаратами и оценить факторы, влияющие на него, и в соответствии с полученнойинформацией модифицировать данный процесс.
Этот механизм может быть использован присоздании или усовершенствовании медицинских препаратов.Достоверность представленных в диссертационной работе результатов подтверждаетсямногократнойповторяемостьюэкспериментов,атакжесоответствиемрезультатовэкспериментов априорной информации и теоретическим данным.Положения, выносимые на защиту:1. Длинноволновоесмещениеспектровфлуоресценциинаномаркеровсемействафлуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов связано с изменениемдипольного момента молекул при возбуждении.
Замещение атомами брома, йода,хлора в структуре флуоресцеина вызывает в ряду Ф → Э → Эр → БР изменениеконфигурации и жесткости ядерной системы и, как следствие, увеличение дипольногомомента молекул при возбуждении.2. Увеличение значения степени анизотропии флуоресценции наномаркеров семействафлуоресцеина в растворах САЧ или БСА обусловлено связыванием наномаркеров сбелками, вызывающим уменьшениевращательнойдиффузиидлягалоген–производных флуоресцеина более чем на порядок.3. Уменьшение вращательной диффузии для 3,5 < pH < 8,0, как в буферных растворах,так и в растворах САЧ или БСА в ряду Ф → Э → Эр → БР связано с увеличениемэлектроотрицательности радикалов боковых групп молекул в том же порядке.4.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
