Автореферат (1105108), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Одинаковый характер спектрально-флуоресцентных зависимостей и закономерностейдля констант связывания наномаркеров семейства флуоресцеина с САЧ и БСА отзначения pH объясняется тем фактом, что зависимость зарядов обоих альбуминов отpH имеет практически идентичный характер, с той лишь разницей, что БСАположительно заряжен при pH < 4,9 и отрицательно заряжен при pH > 4,9, а САЧ вцелом положительно заряжен при pH < 4,7 и отрицательно заряжен при pH > 4,7.5. Уменьшение степени молекулярной ассоциации наномаркеров и изменение структурыассоциатов в растворах САЧ и БСА связано с уменьшением их степени сродства кмолекулам зондов (коэффициент кооперативности n < 1). Поэтому молекулынаномаркеров связываются только с одним связывающим центром сывороточныхальбуминов и к нему уже не могут присоединяться другие молекулы красителя,которые не могут также присоединяться к остальным центрам.
В результате в среде,окружающей белок, концентрация молекул красителя уменьшается и наблюдаетсяуменьшение степени ассоциации.66. Нелинейный характер концентрационного тушения флуоресценции наномаркеров F0− 1 от [Q ] ) обусловлен наличием несколькихF(зависимостей Штерна – Фолмера типов механизмов (ковалентный, ионный) образования комплекса флуоресцентныйкраситель – белок.Апробация работыВоспроизводимость результатов, их соответствие известным экспериментальнымисследованиям обеспечивают достоверность полученных и проанализированных данных. Пополученным в диссертационной работе результатам были опубликованы 23 печатныеработы, из которых 7 – статьи в рецензируемых журналах, входящие в состав перечня ВАК.Также результаты представлены на российских и международных конференциях: «Week ofDoctoral Students 2013» (WDS 2013), Прага, Чешская Республика (4-7 июнь, 2013); XVII,XVIII, XIX, XX и XXI всероссийские конференции «Структура и динамика молекулярныхсистем», Яльчик, Россия (28 июня – 2 июля, 2010; 4-9 июля, 2011; 25-30 июня, 2012; 24-29июня, 2013; 22-27 июня, 2014); XVII и XVIII международные конференции студентов,аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов», Москва, Россия(12-15апреля,2010;11-15апреля,2011);VII,VIIIмеждународныеконференции«Фундаментальные проблемы оптики» Санкт-Петербург, Россия (15-19 октября, 2012; 20-24октября, 2014); VIII международная конференция молодых ученых и специалистов «Оптика2013» Санкт-Петербург, Россия (14 – 18 октября, 2013); V и VI Троицкие конференции«Медицинская физика и инновации в медицине», Троицк, Россия (4-8 июня, 2012; 2-6 июня,2014).Личный вклад автора заключается в выборе объектов исследования, проведенииизмерений и интерпретации полученных результатов.
Содержание диссертации и основныеположения, выносимые на защиту, отражают персональный вклад автора в опубликованныеработы. Подготовка к публикации полученных результатов проводилась совместно ссоавторами, причём вклад диссертанта был определяющим.Структура и объём диссертацииДиссертация состоит из введения, трёх глав, в первой из которых представлен обзорлитературы по теме диссертации, во второй изложена методика эксперимента, а в третьейприведены экспериментальные результаты и их обсуждение, заключения и библиографии.Общий объём диссертации 121 страница, включающих 62 рисунка и 1 таблицу.Библиография содержит 133 наименования.7СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВовведенииобосновываетсяактуальностьтемыдиссертационнойработы,формулируется общая постановка задачи, изложены основные результаты и целипроведенных исследований, описаны положения, выносимые на защиту.Первая глава посвящена описанию используемых в данной работе флуоресцентныхнаномаркеров семейства флуоресцеина (Ф, Э, Эр и БР) и их электростатических свойств,рассмотрению сывороточных альбуминов, применяемых в диссертационной работе, иобсуждению оптических методов и флуоресцентных красителей, используемых для изучениябиологических объектов, таких как кровь, белки, ткани и т.д.
В первой главе описываютсяосновные элементы теории тушения флуоресценции красителей, излагается описаниепроцесса молекулярной ассоциации наномаркеров в растворах.Во второй главе изложена методика эксперимента и описан процесс приготовленияобразцов,используемыхвдиссертационнойработе.Дляполученияданныхофлуоресцентных характеристиках наномаркеров семейства флуоресцеина в буферныхрастворах и растворах САЧ и БСА при варьировании значений pH от 3,5 до 8,0 былииспользованы методы флуоресцентной спектроскопии и спектроскопии поглощения (ввидимой области).
В работе использовались серии образцов различной концентрациикрасителей, различной концентрации сывороточных альбуминов и различной вязкостибуферных растворов. Каждая серия предназначалась для определённых экспериментов,описывающих процесс тушения флуоресценции красителей, процесс взаимодействиянаномаркеров с белком, процесс образования димерных структур флуоресцентных маркеровв растворах.В третьей главе описываются и анализируются экспериментальные данные. Главасодержит 5 параграфов. Первый (§ 3.1) из которых посвящен исследованию исравнительному анализу спектрально-флуоресцентных характеристик исходного соединенияФ и его галоген – производных (Э, Эр и БР) в растворах сывороточных альбуминов приразличных значениях рН.Как показали результаты измерений, для всех четырех красителей наблюдаетсясмещение спектров флуоресценции в длинноволновую (красную) область в растворах белковпо сравнению с максимумами спектров флуоресценции этих зондов в буферных растворах.Величина смещения спектров варьируется в пределах 8-16 нм в зависимости от pH и типананомаркера.
Так, при pH 5,0 для Ф этот сдвиг равен 5 нм, для Эр - 6 нм, Э - 16 нм, а для БР 9 нм. При этом для Э, Ф и Эр в растворах БСА наблюдается уменьшение стоксова сдвига∆ν спектров поглощения и флуоресценции. Для БР наоборот наблюдается увеличение8стоксова сдвига спектров поглощения и флуоресценции. Для Эр и БР зависимость ∆ν от рНимеет аналогичный вид.Для Ф и Э зависимость ∆ν от рН в буферном растворе имеют немонотонный вид, в товремя как в растворе БСА для Ф ∆ν принимает одинаковое значение для всех рН, а для Энаблюдается уменьшение ∆ν с ростом рН.
Для анализа исследованного значения стоксовасдвига ∆ν использовалась следующая формулаɛ−1ℎ = �∆bгде =ɛ+2−2 −1 (22 +1)22 +2�(2 +2)2,(1)2µ 2 − µ*2 − 2µµ* cos a ) − параметр, характеризующий изменение дипольного3 (hcaмомента молекулы при возбуждении, h − постоянная Планка, с − скорость света, a −онзагеровский радиус молекулы, ∆ν − стоксов сдвиг (в см-1), n − показатель преломления,*ε − диэлектрическая постоянная растворителя, µ и µ − дипольные моменты флуорофора ввозбужденном и основном состояниях, α − угол между µ и µ*.В работе были определены значения ∆b и проанализированы зависимости ∆b от рНдля исследованных наномаркеров в растворахбелков по сравнению с буферными растворами.Дляdb =этогобыли∆bбел, где∆bрастввычислены∆bбел − значениеотношения∆bдлярастворовкрасителя с белком, ∆bраств − длярастворовфлуоресцентныхпостроенызависимостимаркеров,db отрНидляисследованных красителей (рис.
1). Рассмотримподробно зависимости db от рН для каждого изисследованных наномаркеров.Эритрозин (рис. 1, кривая 1). В области3,5 < pH < 6,0наблюдается уменьшениевеличины db. Эритрозин может находится либоРис.1. Зависимости db от рН в раствореБСА для Эр(1), Э(2), Ф (3) и БР(4).в нейтральной форме (pH< 3,6) либо в слабо отрицательно заряженной форме (3,6 < pH< 5,5).При этом в данной области рН белки в целом положительно заряжены, т.е. изменениедипольного моментов Эр в возбужденном состоянии происходит из-за электростатическоговзаимодействия. В области pH > 6,0 белки и Эр в целом заряжены отрицательно, поэтомуэлектростатическое взаимодействие с ростом рН уменьшается и разность между дипольными9моментами в основном и возбужденном состояниях уменьшается (наблюдается увеличениеdb).Аналогичная картина изменения db при pH < 5,0 наблюдается и для эозина (рис. 1,кривая 2), потому что при 3,0 < pH < 5,0 молекулы Э слабо отрицательно заряжены инаходятся в форме моноанионов, заряд же белков для pH < pI ( pI - изоэлектрическая точка,равная 4,9 для БСА и 4,7 для САЧ) положителен, поэтому и наблюдается такая зависимостьdb(pH) в этой области рН.
При значениях pH > pI молекулы белков в целом отрицательнозаряжены, но имеют некоторые участки с положительным зарядом с которым и происходитсвязывание наномаркера. Рост рН приводит к уменьшению числа таких участков, изменениюdb, указывающему на уменьшение дипольного момента Э в основном и возбужденномсостояниях.Флуоресцеин (рис. 1, кривая 3). При pH < 4,0 Ф находится в слабо положительнозаряженной форме, поэтому взаимодействия Ф-белок незначительно. При 4,0 < pH < 6,0наблюдается эффективное связывание БСА или САЧ с Ф, т.к.
в этом диапазоне рН молекулыальбуминов слабо отрицательно заряжены, а Ф электрически нейтрален. При 7,0 < pH < 8,0исследуемые объекты имеют отрицательный заряд, поэтому изменения в растворах белкамежду µ и µ незначительны.*Бенгальский розовый. При 3,5 < pH < 4,0молекулы красителя моноанионы (БРзаряжен слабо отрицательно). В этой области рН наблюдается увеличение db (рис. 1, кривая4).При рН > 4,0 молекулыБРнаходятсявформедианионов,заряженысильноотрицательно, что вызывает их экранировку дипольными молекулами воды.
В области 4,0 <pH < 6,0 происходит эффективное связывание БР с белками ( db уменьшается). При pH >4,0 (рис. 1, кривая 4) БР находится в дианионной форме, что приводит к уменьшениюэнергии связывания белков с зондом.Проведенные исследования показали, что при растворении молекул наномаркеров врастворах белков наблюдается изменение не только спектральных, но и энергетическиххарактеристик свечения (например, интенсивности флуоресценции).
В параграфе 3.2представлены результаты исследования влияния белков и рН среды на флуоресцентныехарактеристики наномаркеров семейства флуоресцеина.Было установлено, что в растворах, содержащих белки, для всех четырехисследованных маркеров интенсивность в максимуме спектров флуоресценции в растворахальбуминов уменьшается по сравнению с буферными растворами.10Проведем анализ изменений флуоресцентных характеристик наномаркеров семействафлуоресцеина, происходящихв растворах c белком (САЧ или БСА), по сравнению сбуферными растворами красителей.
Для этого определим отношение(I )maxфлбуф(I )∆I =(I )maxфлбуфmaxфлбел(где− значения интенсивности в максимумах спектра флуоресценции исследуемыхнаномаркеров в буферных растворах,(I )maxфлбел− значения интенсивности в максимумахспектров флуоресценции исследуемых наномаркеров в растворах с белком (бычьим иличеловеческим)значенийдляpH.различныхНарис.2представлены зависимости ΔI отpH для БСА для исследованныхнаномаркеров.Вбуферныхзависимостирастворахинтенсивностивмаксимуме спектра флуоресценциикрасителейобуславливаютсяотформой,pHвкоторойнаходятсямолекулыданногокрасителя(зарядомРис. 2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
