Автореферат (1105108), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Зависимости ΔI от pH для растворов с БСАдля Ф (1), Эр (2), Э (3) и БР (4).молекул зонда: положительным, слабо отрицательным, сильно отрицательным). Взависимости от знака и величины заряда молекул наномаркера экранировка дипольнымимолекулами воды флуоресцентных наномаркеров происходит по-разному. При наличиисильно электроотрицательных атомов в маркерах (I – у Эр, Br – у Э, I и Cl – уБР)происходит сильное взаимодействие красителей с окружающей средой.Из рис.2 видно, что для всех исследованных красителей в растворах, содержащихальбумины (БСА или САЧ) значения интенсивности в максимумах спектров флуоресценции,значительно меньше аналогичных значений для буферных растворов этих красителей.

Приэтом для разных pH это уменьшение различно. Из рис. 2 видно, что рассматриваемые белки висследованном диапазоне pH являются тушителями (вызывают уменьшение интенсивностифлуоресценции). С увеличением значения pH тушение флуоресценции производныхфлуоресцеина (Э, Эр, БР) под действием белков уменьшается (кривые 2-4 рис. 2), чтоуказывает на уменьшение связывания белков и наномаркеров. Из рис. 2 видно, что видзависимости ∆I(pH) для Ф не совпадает с аналогичной зависимостью для его галоген –11производных для низких значений pH (рН < 5,0).

Для этой области рН для Ф наблюдаетсярост ΔI (кривая 1 на рис. 2), в то время как для Э, Эр и БР наблюдается уменьшение ΔI .При рН > 5,0 ход этих зависимостей одинаков: наблюдается уменьшение ΔI с увеличениемрН. Сравнение зависимостей ∆I от pH для растворов красителей, содержащих БСА и САЧ,показало их подобие для одинаковых красителей, объясняющееся тем фактом, чтозависимость зарядов обоих альбуминов от pH имеет практически идентичный характер, с тойлишь разницей, что БСА положительно заряжен при pH < 4,9 и отрицательно заряжен приpH> 4,9, а САЧ в целом положительно заряжен при pH< 4,7 и отрицательно заряжен приpH> 4,7.§3.3посвященпроцессутушенияфлуоресценциинаномаркеровсемействафлуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов.

Для установления его эффективности F0 − 1 для всех наномаркеров и белков различнойFбыли вычислены значенияконцентрации [Q]. Здесь F 0 , F – интенсивности флуоресценции наномаркера в буферныхрастворах и растворах белков (БСА или САЧ), соответственно. Были построены зависимости F0 − 1Fот [Q] (так называемыезависимости Штерна – Фолмера) дляисследованныхсистем.Вкачествепримера на рис.

3 представлены такиезависимости для БР в растворах САЧ.Из рис. 3 видно, что графики Штерна Фольмера имеют нелинейный характер. F0− 1 отFАналогичные зависимости [Q]наблюдаютсяисследованныхидлясистем.другихБылиопределены значения К, а затем итушенияFРис. 3. Зависимости  0 − 1 БР от концентрацииFфлуоресценции красителя, в данномСАЧ при различных значениях pH: 3,5(1); 4,0(2);случае5,0(3); 6,0(4); 7,0(5) и 8,0(6).K сигмконстанта–являющеесяконстантойсвязывания флуоресцентного зонда ссывороточнымальбумином,К сигм = n К , где n – коэффициент кооперативности(коэффициент Хилла).12Всвязистем,чтозависимость, Моль-1 F0 − 1 от [Q] имеет нелинейный характер,Fтодлятакихрасчетовиспользовалиформулу:F0n=1 + K ⋅ [Q ] .F(2)На рис.

4 представлены зависимостифлуоресценцииK сигмсемействафлуоресцеинананомаркеровдлярастворов,содержащих БСА. Из рис. 4 видно, что для ФРис. 4. Зависимости Ксигм от рН для(криваярастворов с БСА для Ф (1); Эр (2); Э (3)1)зависимостьнаблюдаетсянемонотоннаяК сигм ( pH ) с максимумом прии БР (4).pH= 5,0 и pH = 6,0, соответственно. Для других исследуемых красителей семействафлуоресцеина наблюдается монотонное уменьшение K сигм с ростом pH (см. рис. 4, кривые 24).Причем для галоген – производных красителя флуоресцеина (Эр, Э и БР) наблюдаемоеуменьшениеK сигмобъясняетсяизменением заряда наномаркеров ибелков при варьировании pH растворов.Были рассчитаны коэффициентыкооперативности для всех исследованных растворов красителей. На рис.

5представленызависимостиn(pH)наномаркеров для БСА и видно, что длявсей области pH n < 1, т.е. наномаркерысемейства флуоресцеина связываютсятолько с одним связывающим центромсывороточных альбуминов. При этомдля Эр (кривая 2) и БР (кривая 4) приРис. 5. Зависимости n от рН для растворов сбычьим сывороточным альбумином для Ф (1);Эр (2); Э (3) и БР (4).pH < 7,0 происходит изменение сродства активных центров белка к маркеру.В § 3.5 определяется степень молекулярной ассоциации наномаркеров семействафлуоресцеина в растворах САЧ и БСА при различных значениях pH. Были получены и13проанализированы спектры поглощения растворов наномаркеров различных концентраций(С) в растворах с БСА и с САЧ и без них при вариации pH (от 3,5 до 8,0).Степень ассоциации (1 – Х) для молекул каждого из красителей была рассчитана поданным, полученным из спектров поглощения растворов, содержащих бычий сывороточныйальбумин или сывороточный альбумин человека, и растворов, не содержащих белков, приразличных значениях концентрации красителей в рассматриваемом диапазоне pH.Как показали результаты эксперимента и расчетов в буферных растворах для Э, Эр иБР наблюдается рост степени ассоциации при увеличении рН растворов.

Для Ф наблюдаетсянемонотонная зависимость (1-Х) от рН: в области 3,5 < pH < 5,5 происходит увеличениестепени ассоциации Ф, а при pH > 5,5 (1-Х) уменьшается. При этом для всех исследованныхкрасителей наблюдается линейнаязависимость(1-Х)отихконцентрации.При добавлении в буферныерастворымолекулнаблюдаетсяассоциации.различноизмененияЭтодляконцентрацийБСАстепениизменениеразличныхкрасителей.Вкачестве примера, на рис. 6 показаназависимостиDDБСА( DDБСА = (1 − Х ) р − (1 − Х )БСА ,Рис. 6. Зависимость DDБСА Э от концентрациикрасителя и pH.где (1-Х) р –степень ассоциации для растворов наномаркеров, (1-Х) БСА – степень ассоциациидля растворов красителей с белком) Э от pH и концентрации красителя. По мере ростазначений pH в растворах с БСА наблюдается монотонное уменьшение значения степениассоциации для молекул Э и изменение концентрационных зависимостей(1 – Х) посравнению с буферными растворами.Для БР наблюдалось монотонное убывание степени ассоциации красителя сувеличением pH в растворах с и без сывороточных альбуминов.

При небольших значенияхpH рассматриваемого диапазона pH < 4,0 молекулы красителя БР слабо отрицательнозаряжены и находятся в форме моноанионов, что способствует процессу их ассоциации.При более высоких значений pH растворов (pH > 4,0) молекулы БР становятся сильноотрицательно заряжены, приобретают форму дианионов, в результате чего их взаимноеотталкивание препятствует образованию ассоциатов.14Зависимость DDБСА Ф от pH иконцентрации красителя в растворахБСА представлена на рис. 7. Из рис.

7видно, что зависимость DDБСА ( рН )имеет нелинейный характер с максимумприpH=электрически6,0,гдемолекулынейтральны.ФПридобавлении в раствор БСА значения (1X) Ф уменьшаются. Данный эффектобъясняетсямаркерасуменьшениепроцессомбелком.степенисвязыванияПриэтомассоциациивРис. 7. Зависимость DDБСА Ф от концентрации красителя и pH.растворах БСА при различных рНпроисходит не одинаково (рис. 7), но при этом для Ф наблюдается линейная зависимостьΔD БСА (C).В растворах Эр для всех исследованных концентраций красителя и рН средынаблюдается уменьшение степени ассоциации молекул Эр.

Причем в отличие от Э и БР,степень ассоциации Эр в растворах БСА уменьшается с ростом рН и при малыхконцентрациях наномаркера.Также были исследованы процессы ассоциации в растворах САЧ. В результатеисследований было установлено, что для Э и БР зависимости DDСАЧ от рН и концентрациианалогичны зависимостям DDБСА (pH) и ΔD БСА (C) .Для Эр в растворах САЧ наблюдается отличие зависимостиDDСАЧ ( рН ) отаналогичной зависимости для БСА.

Если для БСА с ростом рН происходит уменьшениестепени ассоциации Эр по сравнению с буферным раствором, то для растворов САЧ приконцентрациях Эр больших 30 мкМ эта зависимость нарушается.Для Ф в растворах САЧ наблюдается немонотонность в зависимости DDСАЧ ( рН ) как идля БСА, с одним отличием - для БСА эта зависимость при концентрациях красителя более30 мкМ имеет «двухгорбый» вид (см. рис. 7).В растворах наномаркеров и белков изменяется не только эффективность ассоциации,но и их структура. Для характеристики структуры ассоциатов (димеров) были определеныуглы между мономерными молекулами в димере.15В растворах белков происходит изменение угла между мономерными молекулами вдимере.

Эти изменения зависят как от концентрации молекул красителя, так и от рН среды.На рис. 8 и рис. 9 в качестве примера представлены зависимости изменения угла междумономерными молекулами в димере ∆γ = γ Р − γ БСА (где γ Р − угол в буферном растворе, аγ БСА − в растворе САЧ) для Эр (рис.

8) и Ф (рис. 9).Рис. 8. Зависимость изменения угла∆γ Рис. 9. Зависимость изменения угла ∆γмежду мономерными молекулами в димере междумономернымимолекуламивЭр в САЧ от рН среды и концентрации димере Ф в САЧ от рН среды икрасителя.концентрации красителя.Было установлено, что для Э и БР при увеличении концентрации красителя в раствореБСА угол между молекулами в димере уменьшается.Зависимость ∆γ ( С, рН ) для Эр имеет противоположный вид по сравнению с Э и БР.Для Эр в растворе БСА максимальное уменьшение угла γ наблюдается при рН = 3,5 иминимально при его концентрации 3мкМ.

Причем для Э, БР и Эр зависимости ∆γ ( С )линейны. В то время как зависимости ∆γ ( рН ) для Э и БР линейны, а для Эр наблюдаетсяминимум при рН = 6,0.Для Ф в растворах БСА зависимости ∆γ ( рН ) и ∆γ ( С ) немонотонные с минимумомпри рН = 6,0 и С = 30 мкМ, соответственно.Для Э, БР и Эр зависимости ∆γ ( С, рН ) в САЧ аналогичны этим же зависимостям длярастворов данных красителей в БСА.Значительное отличие в зависимости ∆γ ( рН ) в растворах САЧ и БСА обнаружено дляФ. Если для Ф в растворах БСА минимум в ∆γ ( рН ) наблюдается при рН = 6,0, то16для растворов Ф с САЧ при рН = 6,0 наблюдается максимум в зависимости ∆γ ( рН ) .В §3.5 описываются данные поисследованию параметров вращательной диффузии молекул исследованныхкрасителей семейства флуоресцеина приразных значениях pH,лежащих вдиапазоне от 3,5 до 8,0, в буферныхрастворах и растворах БСА и САЧ.

Дляопределения параметров вращательнойдиффузиибылпроведенанализполяризованной флуоресценции наномаркеров.Вработебылиопределеныкоэффициенты вращательной диффузиимаркеров семейства флуоресцеина вбуферных растворах и растворах БСА иРис.10.Зависимостикоэффициентавращательной диффузии Dвращ для маркеровБР(1), Э(2), Эр(3) и Ф(4) от рН в буферныхрастворах.САЧ для различных значений pH. На рис. 10 представлены зависимости коэффициентавращательной диффузии Dвращ исследованных наномаркеров от рН. Из рис.

10 видно, чтокоэффициент Dвращ увеличивается в ряду БР → Э → Эр → Ф. При этом коэффициентвращательной диффузии БР, Э и Эр не зависит от рН. Для Ф наблюдается нелинейнаязависимость Dвращ ( рН ) .Проведенные эксперименты показали, что в растворах с БСА и с САЧ D вращ всехчетырех наномаркеров меньше, чем в буферных растворах, что объясняется связываниемнаномаркеров с альбуминами. На рис. 11 представлены зависимости отношениякоэффициентов вращательной диффузии маркеров в буферном растворе и растворе БСАБСАDвращбуфDвращот рН среды. Из рис. 11 видно, что в растворах БСА происходит резкое уменьшениекоэффициентов вращательной диффузии для исследованных наномаркеров.

Характеристики

Список файлов диссертации