Диссертация (1105109), страница 9
Текст из файла (страница 9)
В растворах БСАзначения (1-X) для эозина имеют меньшую величину по сравнению созначения (1-X) в растворах без белков, так как часть молекул красителя,образовывавшая раньше ассоциаты друг с другом, при добавлении70альбумина в раствор начинают взаимодействовать с ним, образовывая некомплекс наномаркер – наномаркер, а наномаркер – БСА.Уменьшение степени ассоциациив растворах по сравнению сбуферными растворами больше при больших значениях рН и увеличивается сростом концентрации красителя (см. рис. 3.33).Зависимость DDБСА БР от pH и концентрации красителя в растворахБСА показана на рис.
3.35. Наблюдалось монотонное убывание степениассоциации красителя с увеличением pH в растворах с и без сывороточныхальбуминов. Данное явление носит электростатический характер: отрицательный заряд бенгальского розового увеличивался при росте значений pH.При небольших значениях pH рассматриваемого диапазона, то есть при3,5 < pH < 4,0 молекулы красителя БР слабо отрицательнонаходятсявформезаряжены имоноанионов, что способствует процессу ихассоциации. При рассмотрении болеевысоких(pH > 4,0) молекулы БР становятсясильнозначенийpH растворовотрицательнозаряжены,приобретают форму дианионов, в результате чего их взаимное отталкиваниеРис.
3.35. Зависимость DDБСА БР от концентрации красителя и pH.71препятствует образованию ассоциатов.Зависимость DDБСА Ф от pH и концентрации красителя в растворах БСАпоказана на рис. 3.36. Как видно из рис. 3.36 зависимость DDБСА ( рН ) имеютнелинейный характер с максимум при pH = 6,0, где молекулы Фэлектрически нейтральны. При добавлении в раствор БСА значения (1-X) Фуменьшается при соответствующих концентрациях зонда и соответствующихзначениях pH. Данный факт объясняется процессом связывания маркера сбелком. При этом уменьшение степени ассоциации в растворах БСА приразличных рН происходит не равномерно (рис.
3.36). Но при этомнаблюдается линейная зависимость DDБСА ( СФ ) .Рис. 3.36. Зависимость DDБСА Ф от концентрации красителя и pH.72На рис. 3.37 представлена зависимость DDБСА Эр от pH и концентрациикрасителя в растворах БСA. Из рис. 3.37 видно, что для всех исследованныхконцентраций красителя и рН наблюдается уменьшение степени ассоциациимолекул Эр. Причем в отличие от Э и БР, степень ассоциации Эр в растворахБСА уменьшается с ростом рН и при малых концентрациях наномаркера.При увеличении pH (6,0; 7,0; 8,0) растворов отрицательный заряднаномаркера эритрозина возрастает, молекулы красителя находятся в формедианионов и образованию ассоциатов мешает их взаимное отталкивание.
Приболее низких pH (от 3,5 до 6,0) молекулы флуоресцентного зонда имеютформу моноаниона, поэтомупроцессассоциациипроисходитгораздо эффективнее.DDБСАРис. 3.37. Зависимость DDБСА Эр от концентрации красителя и pH.73Для характеристики изменения эффективности ассоциации красителейот их концентрации в растворах БСА методом наименьших квадратоврассчитан коэффициент наклона А БСА в зависимости (1 − =X ) AБСА [C ] + B .На рис. 3.38 представлена зависимостьAБСА [ рН ] для исследованныхкрасителей.
Из рис. 3.38 видно, что для Э и Эр с ростом рН происходитуменьшение градиента роста степени ассоциации от концентрации. Для БРдля всех значений рН ход зависимостей (1 – Х) от концентрации красителяодинаков (величина А БСА не изменяется - кривая 4, рис. 3.38). Для растворовФ и белка зависимость А БСА (рН) имеет немонотонный вид. При pH < 6эффективность образования ассоциатов с ростом концентрации Ф высока,при этом, при pH > 6образование ассоциатов Ф в растворах БСАпрактически не зависит от его концентрации.БСАРис.
3.38. Зависимости коэффициента наклона А БСА для Э(1), Эр(2), Ф(3) иБР(4) для раствора БСА.74Были исследованы процессы ассоциации в растворах САЧ. В результатеисследований было установлено, что для Э и БР зависимость DDСАЧ от рН иконцентрации аналогична DDБСА от рН и концентрации. На рис.
3.39 дляиллюстрации этого утверждения представлена зависимость DDСАЧ ( С, рН )для БР. Из рис. 3.37 видно, что зависимости DDСАЧ ( С ) и DDСАЧ ( рН )практически одинаковысоответствующим зависимостями для БСА (см.рис. 3.35).ΔDСАЧРис. 3.39. Зависимость DDСАЧ БР от концентрации красителя и pH.75Для Ф (рис. 3.40) в растворах САЧ также наблюдается немонотонность взависимости DDСАЧ ( рН ) как и для БСА, но в области 4 < pH < 7 для всехисследованных концентраций красителя вид зависимостиDDСАЧ ( рН )одинаков, в то время как для БСА эта зависимость отличается, при этом приконцентрациях красителя более 30 мкМ она имеет «двухгорбый» вид (см.рис. 3.36).Для Эр в САЧ также наблюдается отличие зависимостиDDСАЧ ( рН )(рис.3.41) от аналогичной зависимости для БСА.
Если для БСА с ростом рНпроисходит уменьшение степени ассоциации Эр по сравнению с буфернымраствором (рис. 3.37), то для растворов САЧ при концентрациях Эр больших30 мкМ эта зависимость нарушается (рис. 3.41).DDСАЧРис. 3.40. Зависимость DDСАЧ Ф от концентрации красителя и pH.76Рис. 3.41. Зависимость DDСАЧ Эр от концентрации красителя и pH.Таким образом, молекулярная ассоциация наномаркеров семействафлуоресцеина выше в растворах, не содержащих сывороточных альбуминов,по сравнению с растворами с БСА или САЧ при соответствующих значенияхpHиконцентрацийэлектроотрицательностикрасителя.боковыхПриэтомрадикаловчемгалогенбольше–значениепроизводныхфлуоресцеина, тем меньше ассоциатов образуется в растворе красителя.Врастворахнаномаркеровибелковизменяетсянетолькоэффективность ассоциации, но и их структура. Для характеристикиструктуры ассоциатов (димеров) определим угол между мономернымимолекулами в димере.
На рис. 3.42 представлены зависимости угла междумономерными молекулами в димереγдля исследованных наномаркеровсемейства флуоресцеина концентрации 50 мкМ от рН раствора. Из рис. 3.42видно, что с ростом рН для БР, Э и Эр наблюдается увеличения угла междумономерными молекуламив димере. Для Ф в области pH < 6,0 при77увеличении рН наблюдается уменьшениеγ , в то время как в области pH >6,0 увеличение рН приводит к увеличению этого угла.Рис. 3.42. Зависимостиγот рН для БР(1), Э(2), Эр(3) и Ф(4) (концентрациякрасителей равна 50 мкМ).В растворах белков происходит изменение угла между мономернымимолекулами в димере. Эти изменения зависят как от концентрации молекулкрасителя, так и от рН среды.
На рис. 3.43 - 3.46 представлены зависимостиизменения угла между мономерными молекулами в димере ∆γ(где= γ Р − γ БСАγ Р − угол в буферном растворе, а γ БСА − в растворе БСА).Из рис. 3.43, рис. 3.44 видно, что для Э и БР при увеличенииконцентрации красителя в растворе БСА угол между молекулами в димереуменьшается. Максимальное уменьшение угла, равное 80, наблюдается приконцентрации красителя 50 мкМ. С уменьшением рН в растворе Э и БР вБСА наблюдается уменьшениеγ (см. рис. 3.43, рис. 3.44).78Рис. 3.43.
Зависимость изменения угла∆γ между мономерными молекуламив димере Э в БСА от рН среды и концентрации красителя.Рис. 3.44. Зависимость изменения угла∆γ между мономерными молекуламив димере БР в БСА от рН среды и концентрации красителя.79Рис. 3.45. Зависимость изменения угла∆γ между мономерными молекуламив димере Эр в БСА от рН среды и концентрации красителя.На рис. 3.45 представлена зависимость ∆γ ( С, рН ) для Эр.
Видно, что этазависимость для Эр имеет противоположный вид по сравнению с Э и БР. ДляЭр в растворе БСА максимальное уменьшение углаγнаблюдается при рН ==3,5 и минимально при его концентрации 3мкМ (рис. 3.45). Причем для Э, БРи Эр зависимости ∆γ ( С ) линейны. В то время как зависимости ∆γ ( рН ) дляЭ и БР линейны, а для Эр наблюдается минимум при рН = 6,0.Для Ф в растворах БСА зависимости ∆γ ( рН ) и ∆γ ( С ) немонотонные сминимумом при рН = 6,0 и С = 30 мкМ (рис. 3.46).80Рис. 3.46.
Зависимость изменения угла∆γ между мономерными молекуламив димере Ф в БСА от рН среды и концентрации красителя.Аналогичные зависимости для Э, БР и Эр наблюдаются и для растворовданных красителей в САЧ (рис. 3.47 -3.49). Для Эр в растворах САЧ (рис.3.49) «провал» в зависимости ∆γ ( рН ) более значителен по сравнению саналогичной зависимостью для растворов Эр в БСА (рис.
3.45).81Рис. 3.47. Зависимость изменения угла∆γ между мономерными молекуламив димере Э в САЧ от рН среды и концентрации красителя.82Рис. 3.48. Зависимость изменения угла∆γ между мономерными молекуламив димере БР в САЧ от рН среды и концентрации красителя.83Рис. 3.49. Зависимость изменения угла∆γ между мономерными молекуламив димере Эр в САЧ от рН среды и концентрации красителя.84Рис. 3.50.
Зависимость изменения угла∆γ между мономерными молекуламив димере Ф в САЧ от рН среды и концентрации красителя.Значительное отличие в зависимости ∆γ ( рН ) наблюдается в растворахФ в САЧ (рис. 3.50) и БСА (рис. 3.46). Если для Ф в растворах БСА при рН == 6,0 наблюдается минимум в этой зависимости, то для растворов Ф в САЧпри рН = 6,0 наблюдается максимум.85§3.5. Вращательная диффузия наномаркеров семейства флуоресцеина врастворах белка.Вданномпараграфепредставленырезультатыисследованияпараметров вращательной диффузии флуоресцентных красителей семействафлуоресцеина при разных значениях pH.Для определения параметров вращательной диффузии был проведенанализ поляризованной флуоресценции зондов в растворах без белков и сбелком (САЧ или БСА).
Степень поляризации P и степень анизотропии rфлуоресценции маркеров в растворах без белка и с белком (САЧ или БСА)рассчитывалась по значениям I и I ⊥ в максимуме спектров испусканияфлуоресценции маркеров, где I и I⊥– интенсивности свечений,поляризованных по двум взаимно перпендикулярным направлениям.Рис.
3.51. Зависимости степени анизотропии флуоресценции r БР(1), Э(2),Эр(3) и Ф(4) от рН в буферных растворах.Зависимости степени анизотропии флуоресценции rсемейства флуоресцеинананомаркеровот pH в буферных растворах представлены на86рис. 3.51. Из рис. 3.51 видно, что для Э и Эр r не меняется от рН. Для Ф вобласти 6 < pH наблюдается рост степени анизотропии флуоресценции, а приpH > 6 ее уменьшение.На рис. 3.52 представлены такие же зависимости, но для растворовкрасителей в БСА.Рис. 3.52.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
