Диссертация (1105109), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Зависимости степени анизотропии флуоресценции r БР(1), Э(2),Эр(3) и Ф(4) от рН в растворах БСА.Степень анизотропии флуоресценции всех четырех наномаркеровсемейства флуоресцеина r в растворах БСА выше значений r в буферныхрастворах (см. рис. 3.52 и 3.51). Причина деполяризации флуоресценциимаркеров в растворах обусловлена вращательной диффузией их молекул.Деполяризация флуоресценции наномаркеров за счет переноса энергииэлектронного возбуждения не рассматривается, так как концентрация87молекул красителей мала и процесс переноса возбуждения в таких условияхневозможен.Из рис.
3.52 видно совпадение хода кривых r ( pH ) для растворов БСА иСАЧ, при этом наибольшее увеличение степени анизотропии наблюдаетсядля БР, Э и Ф, в то время как для Эр оно незначительно.Следуетотметить,чтозависимостистепенианизотропиифлуоресценции r от pH различаются для флуоресцеина, и для его галоген–производных. Зависимости степени анизотропии r Ф от pH как в буферныхрастворах, так и в растворах белков имеют нелинейный характер (смаксимумом при значении pH = 6,0).
При наличии слабо электроотрицательных атомов водорода в структурной формуле Ф основное влияниена вращательную диффузию маркера оказывают процессы ионизации Ф,определяемые значениями его pK, и процессы его молекулярной ассоциации,что приводит, в свою очередь, к нелинейному виду зависимости степенианизотропии флуоресценции флуоресцеина от pH. Тогда как степеньанизотропии флуоресценции галоген - производных флуоресцеина (Эр, Э иБР) не зависит от pH (в диапазоне 3,5 ≤ pH ≤ 8,0), как в растворах БСА, так ив буферных растворах без белков, что объясняется наличием в молекулахэтих маркеров сильно электроотрицательных атомов (брома, йода, хлора),затрудняющих изменения вращательной диффузии маркеров при вариациизначений pH.
По мере увеличения электроотрицательности атомов вструктурныхформулахмаркеровзначениестепенианизотропииихфлуоресценции возрастает. Степень анизотропии флуоресценции маркероввозрастает в ряду флуоресцеин → эритрозин → эозин → бенгальскийрозовый.Для растворов исследованных наномаркеров в САЧ вид зависимостейr ( pH ) аналогичен с растворами БСА. Только значения r несколько выше.
Нарис. 3.53 представлены эти зависимости.88Рис. 3.53. Зависимости степени анизотропии флуоресценции r БР(1), Э(2),Эр(3) и Ф(4) от рН в растворах САЧ.Экспериментальные значения степени анизотропии флуоресценциипозволяет оценивать параметры вращательной диффузии флуорофоров –коэффициент вращательной диффузии, время вращательной корреляции иэффективный радиус Эйнштейна.В работе были определены коэффициенты вращательной диффузиимаркеров семейства флуоресцеина в буферных растворах и в растворах БСАи САЧ для различных значений pH.На рис.
3.54 представлены зависимости коэффициента вращательнойдиффузии Dвращ исследованных наномаркеров от рН. Из рис. 3.54 видно, чтокоэффициент Dвращ увеличивается в ряду БР → Э → Эр → Ф. При этом89коэффициент вращательной диффузии БР, Э и Эр не зависит от рН, для Фнаблюдается нелинейная зависимость Dвращ ( рН ) .Рис. 3.54. Зависимости коэффициенты вращательной диффузииDвращмаркеров БР(1), Э(2), Эр(3) и Ф(4) от рН в буферных растворах.Проведенные эксперименты показали, что при всех значениях pH врастворах с БСА и с САЧ D вращ всех четырех наномаркеров меньше, чем врастворах без белков, что объясняется связыванием наномаркеров сальбуминами.Нарис.3.55представленызависимостиотношениякоэффициентов вращательной диффузии маркеров в буферном растворе ирастворе БСАБСАDвращбуфDвращот рН среды.
Из рис. 3.55 видно, что в растворах БСАпроисходит резкое уменьшение значения коэффициентов вращательной90Рис. 3.55. Зависимости отношения коэффициентов вращательной диффузиимаркеров в буферном растворе и растворе БСАБСАDвращбуфDвращот рН среды.диффузии для исследованных наномаркеров по сравнению с растворами безбелка. Для БР, Э и Эр это уменьшение более чем на порядок. При этомзависимостиБСАDвращбуфDвращ( рН )для БР, Э и Эр линейные, а для БР и Э простосовпадают. Такое поведениеБСАDвращбуфDвращ( рН ) связано с наличием в их структурныхформулах сильно электроотрицательных атомов, сильно взаимодействующихс полярной окружающей средой (йод – у Эр, бром – у Э, хлор и йод – у БР).Уменьшениежекоэффициентавращательнойдиффузииисходногосоединения – Ф в БСА нелинейно зависит от pH с минимумом 5,0 < pH < 7,0,91что связано с присутствием слабо электроотрицательных атомов водорода вструктуре флуоресцеина, а у галоген - производных флуоресцеинакоэффициент вращательной диффузии практически не зависит от pH (при 3,5≤ pH ≤ 8,0), что связано с наличием в их структурных формулах сильноэлектроотрицательных атомов сильно взаимодействующих с полярнойокружающей средой (йод – у Эр, бром – у Э, хлор и йод – у БР).Для растворов САЧ зависимостиСАЧDвращбуфDвращ( рН ) длявсех наномаркеровсхожи с аналогичными зависимостями для БСА.
В качестве примера, на рис.3.56 представлены эти зависимости для БСА и САЧ.Рис. 3.56. Зависимости отношения DвращФ в буферных растворах ирастворах белков от рН для БСА (1) и САЧ (2).Для рассматриваемого диапазона pH (от 3,5 до 8,0) были определенывремена вращательной релаксации наномаркеров семейства флуоресцеина врастворах сывороточных альбуминов (бычьего и человеческого) и врастворах без белка. Рис. 3.57 и рис. 3.58 демонстрируют увеличение92значений времен релаксации наномаркеров семейства флуоресцеина врастворах, содержащих один из видов сывороточного альбумина (БСА илиСАЧ), по сравнению срастворами без биомолекул.
В растворах без белкавремя вращательной релаксации ξ маркеров семейства флуоресцеинасущественно меньше, чем в растворах БСА и САЧ, при всех исследованныхзначениях pH (3,5 – 8,0). Несвязанные с белками маркеры семействафлуоресцеина имеют небольшое время релаксации, что приводит к слабойполяризации флуоресценции маркеров в растворах без белков.
Связанные сБСА или с САЧ маркеры имеют время релаксации большее времени жизниихфлуоресценции,чтодаетувеличениестепениполяризацииихфлуоресценции в растворах с БСА и с САЧ по сравнению с растворами безбелков.Рис. 3.57. Зависимости времени вращательной релаксации наномаркеров: Ф(1,2), Эр (3,4), Э (5,6), БР (7,8) в буферных растворах (1, 3, 5, 7) и в растворах150 мкМ БСА(2,4,6,8).93Рис.
3.58. Зависимости времени вращательной релаксации наномаркеров: Ф(1,2), Эр (3,4), Э (5,6), БР (7,8) в буферных растворах (1, 3, 5, 7) и врастворах 150 мкМ САЧ (2,4,6,8).В работе также были определены значения эффективного радиусаЭйнштейна R эфф маркеров как в буферных растворах, так и в растворахБСА и с САЧ для различных значений pH. На рис. 3.59 и 3.60 представленызависимости R эфф от рН для исследованных наномаркеров в буферныхрастворах и в растворах белков.
Из этих рисунков видно, что в буферныхрастворахэффективныйрадиусЭйнштейнакаждогонаномаркерапрактически соответствует реальному размеру молекулы наномаркера, а врастворах с БСА и с САЧ эффективный радиус каждого наномаркераявляется не реальным размером, а представляет собой эффективный размер,94отражающийпроцентноесодержаниесвязанногосБСАилиСАЧнаномаркера от его общего количества в растворе.Рис. 3.59. Зависимости эффективного радиуса Эйнштейна наномаркеров: Ф(1,2), Эр (3,4), Э (5,6), БР (7,8) в буферных растворах (1, 3, 5, 7) и в растворах150 мкМ САЧ (2,4,6,8).Как в растворах без белков, так и в растворах с БСА и с САЧ,эффективный радиус молекул флуоресцеина, определяемый из вращательнойдиффузии, нелинейно зависит от pH с максимумом при pH 6,0.
Как врастворах без белков, так и в растворах с БСА и с САЧ эффективный радиусмолекул галоген-производных флуоресцеина, рассчитанный из вращательнойдиффузии, практически не зависит от pH (при 3,5 ≤pH≤ 8,0).95Эффективный радиус флуоресцеина в среднем равен 1,0 нм в растворахбез БСА или САЧ при разных значениях pH, при добавлении в растворысывороточныхальбуминов(бычийсывороточныйальбуминилисывороточный альбумин человека) R эфф возрастает до 1,4 – 1,8 нм, чтоявляется показателем связывания красителя с белком; так же важно отметить,что не весь флуоресцентный зонд связывается с биомолекулами (размеррассматриваемых белков порядка 9 нм).Рис. 3.60.
Зависимости эффективного радиуса Эйнштейна наномаркеров: Ф(1,2), Эр (3,4), Э (5,6), БР (7,8) в буферных растворах (1, 3, 5, 7) и в растворах150 мкМ БСА (2,4,6,8).Значение R эфф Эр в растворах, не содержащих БСА или САЧ, равно1,17 нм при различных pH, при добавлении в раствор одного израссматриваемых видов сывороточного альбумина значение изменяется до962,40 нм, что характеризует связь Эр и указывает на то, что не весь красительсвязался с белком, размер которого равен приблизительно 9 нм.R эфф красителя эозина в растворах без сывороточных альбуминов всреднем равен 1,20 нм, в растворах с БСА или с САЧ его значениеувеличивается до 2,65 нм, что характеризует связывание молекул эозина содним из видов белка, или с бычьим сывороточным альбумином или ссывороточным альбумином человека, и даёт информацию о том, что не весьнаномаркер присоединяется к белку.Значения R эфф бенгальского розового в растворах с сывороточнымиальбуминами равно 2,87 нм, что говорит о связывании наномаркера с белком,в растворах без белка величина R эфф равна в среднем 1,27 нм.Как видно из значений эффективного радиуса, полученного из данныхвращательной диффузии, в растворах с БСА и с САЧ в каждом случае далеконе всё количество каждого наномаркера семейства флуоресцеина связываетсяс белками.97ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
