Диссертация (1105109), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Для других исследуемых красителей семействафлуоресцеина наблюдается монотонное уменьшение K сигм с ростом pH (см.рис. 3.18, рис. 3.19 кривые 2-4). Причем если для Э и БР наблюдаетсяаналогичный ход кривых K сигм (pH) в растворах БСА и САЧ, то для Эр в56, Моль-1Рис. 3.18. Зависимости К сигм от рН для растворов с бычьим сывороточнымальбумином для Ф (1); Эр (2); Э (3) и БР (4)., Моль-1Рис. 3.19. Зависимости К сигм от рН для растворов с сывороточнымальбумином человека для Ф (1); Эр (2); Э (3) и БР (4).57этих растворах ход зависимостиK сигм (pH)отличается.
На рис. 3.20представлены эти зависимости для растворов САЧ и БСА и видно, что вобласти pH< 5,0 значение K сигм для САЧ больше чем для БСА. При pH > 5,0,наоборот, константа тушения флуоресценции красителя для БСА меньше,чем для САЧ., Моль-1Рис. 3.20. Зависимости К сигм от рН для растворов Э с САЧ (1) и БСА (2).Уменьшение K сигм для галоген – производных красителя флуоресцеина(Эр, Э и БР) объясняется изменением заряда наномаркеров и белков приварьировании pH растворов. Нелинейный характер зависимости K сигм (pH)также состоит в изменении зарядов белка и зонда.Былирассчитаныкоэффициентыкооперативностидлявсехисследованных растворов.
На рис. 3.21 и 3.22 представлены зависимостиn(pH) для БСА (рис. 3.21) и САЧ (рис. 3.22) и видно, что для всей области pHn < 1.58Рис. 3.21. Зависимости n от рН для растворов с бычьим сывороточнымальбумином для Ф (1); Эр (2); Э (3) и БР (4).Рис. 3.22. Зависимости n от рН для растворов с сывороточным альбуминомчеловека для Ф (1); Эр (2); Э (3) и БР (4).59Для коэффициента Хилла справедливы следующие соотношения:1) n > 1 (положительный).
Когда связывание одной молекулы красителя сактивным (связывающим) центром белка увеличивает сродство к маркеруостальных активных центров;2) n < 1 (отрицательный) – означает обратное, то есть уменьшение сродства;3) n = 1 – не наблюдается кооперативного эффекта.Для исследованных систем n < 1, т.е. наномаркеры семействафлуоресцеинасвязываютсятолькосоднимсвязывающимцентромсывороточных альбуминов. При этом, как видно из Рис.3.21, Рис. 3.22, для Эр(кривая 2) и БР (кривая 4) при pH< 7,0 происходит изменение сродстваактивных центров белка к маркеру. Для Ф наблюдается сложный характерзависимости n от pH.
Таким образом, коэффициент кооперативности присвязывании зондов с белками для обоих видов белка отрицательный, то естьдля обоих типов белков (БСА и САЧ) степень сродства к последующиммолекулам зондов при связывании с ними уменьшается. Только один из всехсвязывающих центров рассматриваемых белков отвечает за присоединениек СА зондов семейства флуоресцеина. С данным центром (центром I) БСАиСАЧпроисходитсвязываниефлуоресцентныхкрасителей.Послесцепления зонда с центром к нему уже не может присоединиться другаямолекула красителя, в тоже время другие молекулы наномаркеров не могутприсоединиться к остальным центрам, что объясняет значение коэффициентаХилла.§ 3.4. Молекулярная ассоциация наномаркеров семейства флуоресцеинав белковых растворахУвеличение концентрации люминесцирующих молекул в растворахобычно приводитк развитию процессов их ассоциации и образованиюагрегатов различной сложности (самые простые димеры).
В результате врастворе появляются новые поглощающие центры. Возникновение таких60агрегатов приводит к изменению оптических свойств растворов. Процессыассоциации зависятот концентрации, температуры, рН, способностирастворителя образовывать водородные связи и т.д. Поэтому следуетожидать влияние на эти процессы содержание белков в растворах.В работе [46] было исследовано образование ассоциатов несколькихкрасителей флуоресцеинового ряда и их структуры в растворах САЧ дляразных рН при их неизменных концентрациях. Однако при измененииструктурыбелковвозникаютлокальныеобластисповышеннойконцентрацией наномаркеров.
Поэтому представляет интерес измененияпроцессов ассоциации красителей в растворах белков при различныхконцентрациях. В данном параграфе представлены результаты исследованияпроцессов ассоциации молекул красителей семейства флуоресцеина (Ф, Э,Эр и БР) в растворах СА в диапазоне pH от 3,5 до 8,0.Величинананомаркерастепенимолекулярнойпредставляетсобойдолюассоциации(1-Х)раствораассоциированныхмолекулнаномаркера в растворе, где Х – доля мономерных молекул, и определяетсяпо стандартной методике разложения спектра поглощения наномаркера–красителя на компоненты мономеров и ассоциатов. Были получены ипроанализированы спектры поглощения растворов наномаркеров различныхконцентраций в растворах с СА и буферных растворах при вариации pH (от3,5 до 8,0) и определены степени ассоциации растворов и структуры,образующихся димеров. На Рис.
3.23 и Рис. 3.24 в качестве примерапредставлены спектры поглощения одного из красителей, а именно БРконцентрации 50 мкМ, в растворах с БСА и с САЧ и без белков. Для всехполученных спектров поглощения красителей семейства флуоресцеина, как врастворах без альбуминов, так и в растворах с ними, было обнаружено двамаксимума поглощения (коротковолнового максимума, характеризующегоналичиеассоциатовфлуоресцентныхмаркеровврастворе,идлинноволнового максимума, соответствующего мономерам исследуемых вданной работе зондов).61Рис. 3.23.Спектр поглощения БР в буферном растворе.62abРис. 3.24.
Спектры поглощения БР в растворах БСА (a) и САЧ (b).63На рис. 3.25- 3.28 представлены зависимости степени ассоциации (1-X)для исследованных маркеров в зависимости от рН раствора и концентрациикрасителей (С).Рис. 3.25. Зависимость степени ассоциации Э от его концентрации и рНбуферного раствора.Рис.
3.26. Зависимость степени ассоциации Эр от его концентрации и рНбуферного раствора.64Рис. 3.27. Зависимость степени ассоциации БР от его концентрации и рНбуферного раствора.Рис. 3.28. Зависимость степени ассоциации Ф от его концентрации и рНбуферного раствора.65Из рис. 3.25 - 3.27 видно, что для Э, Эр и Бр наблюдается рост степениассоциации при увеличении рН растворов. Для Ф (рис. 3.28) наблюдаетсянемонотонная зависимость (1-Х) от рН: в области 3,5 < pH < 5,5 происходитувеличение степени ассоциации Ф, а при pH > 5,5 (1-Х) уменьшается.
Приэтом для всех исследованных красителей наблюдается линейная зависимость(1- Х) от их концентрации (С). В качестве примера на рис. 3.29 представленазависимость (1 – Х) от концентрации Э при рН=7,0.1-ХРис. 3.29. Зависимость (1 – Х) от концентрации Э в буферном растворе прирН = 7,0.Для характеристики изменения эффективности ассоциации красителейот их концентрации методом наименьших квадратов был рассчитанкоэффициент наклона А р в зависимости (1 − X=) Ap [C ] + B . На рис. 3.30представлена зависимость Ap [ рН ] для исследованных красителей.
Из рис.3.30 видно, что для Э, Эр и БР при увеличении рН (до 5,5) наблюдаетсяуменьшение А р . При дальнейшем увеличении рН изменения А р для этихкрасителей практически не наблюдается (кривые 1 – 3, рис. 3.30). Для Ф при66увеличении рН до значения 5,5 А р не изменяется, дальнейший рост рНприводит к уменьшению А р (см. рис. 3.30, кривая 4).Рис. 3.30.
Зависимость А р от рН в буферных растворах Э(1), Эр (2), БР (3) иФ (4).При добавлении в буферные растворы молекул БСА наблюдаетсяизменения степени ассоциации. В качестве примера на рис. 3.31 - 3.32Рис. 3.31. Зависимости степени молекулярной ассоциации Ф (30мкМ) от рН вбуферных растворах (1) и растворах БСА (2).67Рис. 3.32. Зависимости степени молекулярной ассоциации галогенпроизводных флуоресцеина (30мкМ) от pH Э (1,2), Эр (3,4), БР (5,6) вбуферных растворах (1,3,5) и растворах БСА (2,4,6).68представлены зависимости (1 –Х) от рН для исследованных красителей вбуферных растворах и растворах белков (концентрация красителя одна и таже 30 мкМ).
Это изменение различно для различных концентрацийкрасителей.На рис. 3.33 показана зависимости DDБСА ( DDБСА = (1 − Х ) р − (1 − Х )БСА ,где(1 – Х) р , (1 – Х) БСА – степень ассоциации наномаркера в буферномрастворе и с белком соответственно) Э от pH и концентрации красителя. Помере роста значений pHв растворах с БСА наблюдается монотонноеубывание значения степени ассоциации для молекул Э. При этом в растворахБСА изменяется зависимость (1 – Х) от концентрации Э по сравнению сбуфернымирастворами.На рис.
3.34представленызависимостиРис. 3.33. Зависимость DDБСА Э от концентрации красителя и pH.69Рис. 3.34. Зависимости коэффициента наклона А БСА для Э для буферногораствора Э (кривая 1), для раствора Э и БСА (кривая 2) и их разности(кривая 3).коэффициента наклона зависимостей (1 – Х) от С Э для буферного раствора(кривая 1), для раствора БСА (кривая 2) и их разности (кривая 3). Из рис.3.34 видно, что разница в коэффициентах наклона зависимостей (1 – Х) от Сдля Э с ростом рН уменьшается.Следует отметить, что для растворов, не содержащих альбуминов,наблюдается такой же ход зависимости DDБСА [ рН ] , который связан с темфактом, что при pH в диапазоне (3,0 - 5,0), молекулы Э имеют слабоотрицательно заряженную форму моноаниона и процесс их ассоциацииоблегчен по сравнению с процессом образования ассоциатов при pH > 5,0 (вданной ситуации молекулы Э находятся в дианионной форме и процессуобразования димеров мешает их взаимное отталкивание).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
