Диссертация (1105109), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Разные полосы16поглощениясоответствуютразнымэлектроннымпереходамвнутримолекулы.Молекулярныеконцентрационномувзаимодействияувеличениюразвиваютсялюминесцирующегоблагодарявещества,чтоприводит к явлению ассоциации молекул флуорофора (образованиюкомплексов молекул различной сложности и величины). Благодаря этомупроцессу в исследуемом растворе наблюдаются не только мономерныемолекулы, но и новые поглощающие или излучающие центры. Оптическиесвойства раствора (люминесценция, квантовый выход, электронные спектрыпоглощения и др.) изменяются при ассоциации. Причиной этих измененийявляются сложные межмолекулярные взаимодействия в растворах иразличная природа сил, отвечающих за образование ассоциатов.
Выделяютдвеверсиисозданияприсоединенияассоциатов:молекулвлияниепосредствомсилВан-дер-Ваальсаводородныхсвязей.иДлявандерваальсовского случая за сближение и объединение в полимерныеагрегатыотвечаетдиполь-дипольноевзаимодействиемолекул.Предположение о получении ассоциатов благодаря водородным связямподтверждаетсязависимостьюэффективностипроцессаобразованиясложного комплекса молекул от природы используемого растворителя исамой структуры молекул красителя, что было продемонстрированопосредством измерения инфракрасных спектров поглощения растворовкрасителей [6,7].При наличии в исследуемом растворе смеси из мономеров и димеровкрасителя показатель поглощения α на некоторой длине волны λ iзаписывается в виде [8]α = α M X + α A (1-X) = (α M – α A )X + α A ,(1.16)где α M – показатели поглощения мономеров исследуемого раствора на длиневолны λ i ; α A – показатели поглощения ассоциатов исследуемого раствора надлине волны λ i ; X – доля молекул красителя, имеющих мономерное17состояние; 1–X– доля его ассоциированных молекул (называемая степеньюассоциации раствора).При достижении определенного значения концентрации формируютсяболее сложные ассоциаты и раствор перестаёт быть бинарным.
Вследствиеэтого появляются несколько поглощающих центров и формула (1.16)перестаёт выполняться.Изменениеспектровпоглощенияпосредствомувеличенийконцентраций позволяет найти величину степени ассоциации исследуемыхрастворов (1-Х), применяя закон разведения Оствальда и формулу (1.16)X2/(1-X) = M/С ,(1.17)где M – константа равновесия; С – общая концентрация раствора.При решении системы уравнений (1.16) и (1.17) получают(α-α A )2 / (α M - ) = M (α M -α) / C,(1.18)в этом выражении содержится две неизвестных величины α A , M. Чтобы ихопределить можно рассмотреть два произвольных спектра поглощения изсемейства изучаемых растворов с различными концентрациями C 1 и C 2 .
Дляэтих спектров справедливы два уравнения типа (1.18):(α n -α A )2 / (α M -α A ) = M (α M - ) / ,(1.19)α A = (α 1 -Q α 2 ) / (1-Q),(1.20)где n = 1 или 2. Решение системы уравнений (1.19) даёт выражение дляпоказателя поглощения α A на выбранной длине волны λ i :гдеC (α −α )Q= � 2 M 1.C (α −α )1M2(1.21)Теперь, зная величины α M и α A и экспериментальным путём определивзначение показателя поглощения раствора концентрации С, применяяуравнение (1.16) можно определить его долю мономеровX=( α – α A ) / (α M – α A ),(1.22)и величину степени ассоциации раствора (1-X).18§1.4. Флуоресцентные наномаркеры семейства флуоресцеинаФлуоресцирующие наномаркеры (красители, маркеры, зонды) имеютширокое применение в биофизике, медицине, биологии, фармакологии,химии.
Флуоресцентным зондом называют флуоресцирующее вещество,котороепри добавлении в раствор с биологическими объектами(мембранами, белками, липопротеинами, клетками и т.п.) связывается сними. По данным флуоресценции зонда в биологической системе получаютинформацию о структуре, конформационных изменениях и функцияхбиологических объектов [9-16].Использование флуоресцентных зондов в исследованиях белковыхмакромолекул дает большую информацию о строении белковых молекул и офизико-химическом состоянии отдельных участков (сайтов) на белковыхмакромолекулах. Флуоресцентные молекулярные зонды тонко чувствуютизменения своего окружения и являются высокочувствительными датчикамиизменений, происходящих с белковыми молекулами.Процесс связывания лигандов с сывороточным альбумином обусловленналичием на белке так называемых связывающих центров.
Для исследованияI связывающего центра сывороточных альбуминов используются анионныепри физиологическом pH 7,4 флуоресцентные наномаркеры семействафлуоресцеина (флуоресцеин (Ф), эозин (Э), эритрозин (Эр), бенгальскийрозовый (БР)), соединяющиеся непосредственно с ним. Структурныеформулы данных флуоресцентных зондов представлены ниже на Рисунке 1.1.Ф и его производные являются флуороновыми красителями, которыепринадлежат классу ксантеновых флуорофоров (главным структурнымэлементом у них является ксантеновый трицикл).Своей популярностью флуоресцеин обязан тому факту, что квантовыйвыход флуоресценции его дианионной формы молекулы близок к единице.То есть безызлучательные переходы с S 1 на S 0 и T почти не происходят.Атомы боковых радикалов различной электроотрицательности унаномаркеров семейства флуоресцеина (водорода (у Ф), йода (у Эр), брома (у19Рис.
1.1. Структурные формулы красителей семейства флуоресцеина(флуоресцеина (a), эритрозина (b), эозина (с) и бенгальского розового (d)) изначения pK ионизированных групп.Э), хлора и йода (у БР)) влияют на флуоресцентно – спектральныехарактеристики и параметры молекулярной ассоциации зондов, а также наpKихионизируемыхгрупп(COOHиOH).Присутствиеболееэлектроотрицательного атома в структурной формуле флуоресцентногокрасителя приводит к сильному уменьшению pK(COOH) и pK(OH) этихзондов.Для Ф параметры pK карбоксильной и гидроксильной групп имеютследующие значения: pK(OH) = 6,8; pK(COOH) = 8,0.
При значениях pHменьших 5, Ф слабо положительно заряжен. В области pH 5,5 – 6,8 Фнаходится в электрически нейтральной форме. При значениях pH 6,8 – 8,0 Фслабо отрицательно заряжен и является моноанионом. При pH больших 8,0Ф дианион и находится в сильно отрицательно заряженной форме.20Для наномаркера Э pK(OH) = 3,0; pK(COOH) = 5,0, то есть призначениях pH < 3,0 он электрически нейтрален, при3,0 < pH < 5,0 оннаходится в слабо отрицательно заряженной форме (моноанион). При pHвыше 5,0 Э является дианионом и заряжен сильно отрицательно.Для флуоресцентного красителя Эр pK(OH) = 3,6; pK(COOH) = 5,5.Если pH < 3,6 Эр находится в электрически нейтральной форме. При pH 3,6 –5,5 Эр моноанион и слабо отрицательно заряжен. В области pH > 5,5 Эрдианион и сильно отрицательно заряжен.Для флуоресцентного зонда БР pK(OН) = 2,6, pK(COOH) = 4,0.
ПриpH < 2,6 БР электрически нейтрален, в области 2,6 < pH < 4,0 он находится вслабо отрицательно заряженной форме и является моноанионом, при pH > 4,0этот наномаркер является дианионом и сильно отрицательно заряжен.Такимобразом,флуоресцеинавыборобусловленвышеописанныхвозможностьюкрасителейнаблюдениясемействапостепенноговарьирования физико – химических свойств наномаркеров в растворах с и безбелка, так как в ряду флуоресцеин – эозин – эритрозин – бенгальскийрозовый происходит последовательное замещение атомов водорода (Н)атомами галогенов (Br –у Э, I –у Эр, I и Cl–у БР), что изменяет электроннуюи влияет на пространственную структуры, вызывает перераспределениечастичных зарядов между атомами и модифицирует другие физическиесвойства.§1.5.
Сывороточные альбумины (человеческий, бычий)Бычий сывороточный альбумин (БСА) и сывороточный альбуминчеловека (САЧ) - глобулярные белки семейства сывороточныхальбуминов(СА), составляющие около 70% от всех белков. Следует упомянутьнесколько важных характеристик для СА: значение изоэлектрической точкиpI (то есть величина pH, при котором белок в целом электрически нейтрален)для БСА равно 4,9, для САЧ – 4,7; молекулярная масса БСА равна 64 кДа, уСАЧ – 66,4 кДа.21Первичная структура СА определяется единственной полипептиднойцепью каждого из белков.
Она состоит из 582 для БСА и 585 для САЧаминокислотных остатков. При их изучении и сопоставлении [17] былообнаружено 75% совпадение, то есть бычий сывороточный альбумин ичеловеческий СА имеют схожую способностью к присоединению разныхлигандов. Вторичная структура бычьего и человеческого СА включает в себяпо большей части a-спиральные участки и участки хаотической укладки прифизиологическом значении pH (7,4), но также присутствуют β-складчатыеструктуры.ТретичнаяструктураобоихвидовСАопределяетсятремягомологичными доменами, каждый из которых состоит из двух субдоменов(рис.
1.2). СА в водном растворе при физиологических условиях имеют образсхожий с видом сердца и можно сравнить форму сывороточного альбуминас правильной треугольной призмой (со стороной основания длиной 8 нм и свысотой – 3 нм). Оба белка являются типичными представителямигомологичного семейства альбуминов и имеютсхожее строениеснебольшими различиями, в частности, в отличие от САЧ, обладающегоодним остатком триптофана (Trp 214), БСА имеет в своей аминокислотнойцепи два остатка триптофана – Trp 135 и Trp 214.Сывороточный альбумин составляет большую часть от всех белковплазмыкровиорганизма,егомолекулярнаяструктурабыларасшифрована [18-22].
Он продуцируется в печени и выполняет ряд важныхфизиологических функций, а именно поддержание коллоидно-осмотическогодавления и перенос физиологических метаболитов (обладает способностьюсвязываться с низкомолекулярными соединениями) [21-23]. В плазме кровисуществует несколько белков, осуществляющих транспортную функцию, нотолько сывороточный альбумин способен присоединять обратимо такойширокий круг лигандов. Последняя из вышеперечисленных функций САпредставляет особый интерес по причине осуществления переноса не толькопродуктов жизнедеятельности организма, например, билирубина, уробилина,22желчных элементов, но и ядов, и лекарств (некоторые виды антибиотиков,пенициллин, гормоны, сульфаниламид, варфарин, фенитоин, и др.).За транспорт разных структурных классов лигандов молекулой САотвечают различные специфичные центры связывания. В частности, естьшесть главных связывающих центров САЧ: центр I и II – для связываниямалых органических молекул (на рис.
1.2 они обозначены, как Site I и Site II),центры III и IV – для длинноцепочечных жирных кислот, центр V – длялигандов со свободной SH-группой, центр VI – для связывания ионовметаллов.Некоторыереакциисвязыванияпроисходятэлектростатическим взаимодействиям, другие, провоцируяблагодаряхимическиеРис.1.2. Доменная структура сывороточного альбумина.модификациибоковыхрадикаловаминокислотныхостатков,носятковалентный характер.§1.6.
Применение флуоресцентных наномаркеров в исследованияхбиологического материалаФлуоресцентная спектроскопия вносит значительный вклад в изучениебиологических объектов, как их нативных форм, так и перетерпевшихизменения под воздействием окружающей среды и других внешних23факторов.Исследованияфлуоресцентныхнаномаркеровпозволяютрасширить область применения, изучить подробнее сам биологическийобъект и его взаимодействие с различными лигандами, что представляетглубокий интерес с точки зрения биомедицины, фармацевтики.Метод флуоресцентной спектроскопии используется для описанияхарактеристикфлуоресцентныхнаномаркеров[24-26],дляописанияструктуры и поведения биологического материала при изменении егоокружающей среды [27-31] и для получения информации о взаимодействиибиологических образцов с красителями [32-39].В статье [40] изучается взаимодействие антрахиноновых красителей,полученных из корней Rheumemodi, с белками.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
