Диссертация (1105109), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Спомощью межмолекулярных водородных связей объясняется сдвиг вдлинноволновую область спектров поглощения и спектров флуоресценциикрасителей при взаимодействии флуоресцентных маркеров с растворителем.Применениеобширныйфлуоресцентныхкругисследованиямипроблем,наномаркеровсвязанныхбиологическогосоматериала–позволяетрешатьспектроскопическимиполучениекартиныиосуществление мониторинга биологических систем, изучение структурынативных и поврежденных клеток, тканей, белков и других биообъектов, атакже исследование их характеристик, изменяющихся в зависимости отповедения окружающей среды. Метод флуоресцентной спектроскопиипозволяет получать данные при изучении биологического материла как invivo (при введении флуорофора прямо в пораженную область живогоорганизма),такиinvitro,приналичиималогоколичестваэкспериментального образца за небольшой промежуток времени.
Данныефакторы заставляют внимательно исследовать возможные пути примененияфлуоресцентныхзондоввклиническойдиагностике,фармацевтике,биофизике, спектроскопических исследованиях.30ГЛАВА II. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА§2.1. Приготовление растворов наномаркеров семейства флуоресцеинадляизученияихфлуоресцентныххарактеристикврастворахальбуминов (бычьего, человеческого)Для исследования были сначала приготовлены буферные растворы сразличными рН:1) 0,1 M CH 3 COOH – KOH (pH 3,5-5,0);2) 0,1 M KH 2 PO 4 – 0,1 M NaOH (pH 6,0-8,0).Затемизбуферныхрастворовбылиприготовленырастворынаномаркеров флуоресцеина (Ф), эозина (Э), эритрозина (Эр) и бенгальскогорозового (БР) со значениями концентраций 3 - 50 мкМ.Для исследования влияния белка на спектрально-люминесцентныехарактеристики в растворы с перечисленными выше наномаркерами (3 мкМ)добавляли сывороточный альбумин человека САЧ или бычий сывороточныйальбумин БСАразличной концентрации (10 – 150 мкМ) при различныхзначениях pH (3,5 – 8,0).Для оценки возможного влияния растворов сывороточных альбуминови флуоресцентных маркеров на изменение pH буферных растворов за счетмногократного приготовления образцов и измерений при одних и тех жеусловиях, было показано, что влияние красителей, САЧ и БСА на значениеpH минимально.§2.2.Измерениеспектровпоглощенияиопределениестепенимолекулярной ассоциации и угла между молекулами в ассоциацииИзмерение спектров поглощения данных наномаркеров в буферныхрастворах и растворах сывороточных альбуминов были проведены наспектрофотометре Perkin Elmer Lambda 35 при комнатной температуре.Спектры поглощения наномаркеров в растворах регистрировались в31диапазоне 300 – 700 нм, использовались стандартные кварцевые кюветы10х10 мм.Выделение спектров мономеров и димеров осуществлялось путемвыделения из суммарного спектра гауссовых компонент с помощьюпрограммы UVWINLAB (PerkinElmer).Доля мономеров Хв исследованных растворах определялась какМSпоглМрастотношение раст , где Sпогл− площадь спектра поглощения мономеров, Sпогл−Sпоглплощадь спектра поглощения раствора.
При этом степень ассоциации равна1-Х.Угол γ между молекулами красителей в ассоциате (димере) определялсяпо формуле[129]tg 2g fмν д=,2 f дνм(2.1)где f м и f д − силы осцилляторов в коротковолновой полосе димера идлинноволновойполоседимера,соответственно,равныеплощадямсоответствующих спектров; ν м и ν д − частоты максимумов длинноволновыхи коротковолновых спектров димера.§2.3. Измерение спектрально-люминесцентных характеристик растворовнаномаркеров.Измерения флуоресцентных характеристик наномаркеров в растворахбез и с сывороточными альбуминами (БСА или САЧ) проводились наспектрофлуориметре Perkin Elmer LS 55 при комнатной температуре.Флуоресценция красителей исследовалась в следующих условияхa) Флуоресцеин возбуждение длинойволныλ возб = 440 нм,флуоресценция регистрировалась в области 450 – 700 нм.b) Эозин возбуждение длиной волныλ возб = 520 нм, флуоресценциярегистрировалась в области 530 – 700 нм.32c) Эритрозин возбуждение длиной волны λ возб = 530 нм, флуоресценциярегистрировалась в области 540 – 700 нм.d) Бенгальский Розовый возбуждение длиной волныλ возб = 540 нм,флуоресценция регистрировалась в области 550 – 700 нм.Полученные спектры обрабатывались программой FLWINLAB (PerkinElmer).Степень анизотропии r определялась по формуле =∥ − ⊥,∥ + 2⊥(2.2)где I - параллельная электрическому вектору возбуждающего светасоставляющая поляризованной флуоресценции; I ⊥ - перпендикулярнаяэлектрическомувекторувозбуждающегосветасоставляющаяполяризованной флуоресценции.Для определения параметров вращательной диффузии наномаркеровбыли рассчитаны значения r красителей, при этом исследования проводилисьпри различных значений вязкости η исследуемых образцов.
Вязкостьрастворов изменялась путем добавления различных концентраций сахарозы.Теоретическая зависимость1T описывается формулой Левшина –r η Перрена1 1 kT 1+=τ0 ,r r0 V η (2.3)где T – абсолютная температура; η - вязкость раствора; V – объем раствора;k – постоянная Больцмана;τ 0 – среднее время жизни возбужденных молекул;r 0 – предельная анизотропия излучения.Уравнение (2.3) описывает линейную зависимостьT1от , т.е.
можетηrбыть представлено в виде331T= A⋅ + B ,rηгде A − коэффициент наклона прямой(2.4)1T , равныйr η k τ0,V ⋅ r0A=(2.5)а B есть отрезок, отсекаемый прямой на оси ординат, равныйB=1.r0(2.6)Для каждого из растворов методом наименьших квадратов были построенызависимости1T и определены значения А и В.
Используя формулы (2.4 r η 2.6) можно записать выражение для молекулярного объемаV=k τ0 B.A(2.7)Используя известные значения τ0 по формуле (2.7) были вычисленызначения молекулярного объема для всех исследованных систем, а затемэффективный гидродинамический радиус Эйнштейнаa=33V.4π(2.8)Используя полученные значения молекулярного объема V, былиопределенывремя вращательной релаксации (или разупорядочиваниявследствие тепловой диффузии) ξ флуорофора и коэффициент вращательнойдиффузии D вращ по формулам:ξ=Vη,TkDвращ =kT.6ηV(2.9)(2.10)34Глава III.
СПЕКТРАЛЬНО - ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИНАНОМАРКЕРОВСЕМЕЙСТВАФЛУОРЕСЦЕИНАВРАСТВОРАХ БЕЛКОВ (РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ)§ 3.1. Спектральные характеристики флуоресценции наномаркеров врастворах альбуминовВданномпараграфепредставленырезультатыисследованияспектрально - люминесцентных характеристик наномаркеров семействафлуоресцеина (Ф, Э, Эр и БР) в растворах сывороточного альбуминачеловека (САЧ) и бычьего сывороточного альбумина (БСА) при различныхзначениях рН. Были получены спектры флуоресценции данных наномаркеровв буферных растворах и растворах, содержащих САЧ и БСА при различныхзначениях pH. В качестве примера, на рис. 3.1 – 3.4 представлены спектрыфлуоресценции БР в растворах БСА и САЧ, Ф и Э в растворах БСА.
Какпоказали результаты измерений для всех четырех красителей наблюдаетсясмещение спектров флуоресценции в длинноволновую (красную) область врастворах белков по сравнению с максимумами спектров флуоресценцииэтихзондоввбуферныхрастворах.Величинасмещенияспектровварьируется в пределах 8-16 нм в зависимости от pH и типа наномаркера.Так, при pH 5,0 для Ф этот сдвиг равен 5 нм, для Эр - 6 нм, Э - 16 нм, а дляБР - 9 нм.Известно, что на спектры флуоресценции молекул влияет полярностьокружающей среды [2, 3]. При этом стоксов сдвиг спектров поглощения ифлуоресценции изменяется в зависимости от окружения флуорофора. Этиизменения связаны с различными динамическими процессами (диссипацияколебательной энергии, перераспределение электронов в окружающихфлуороформолекулрастворителя,изменениедипольногомоментафлуорофора при возбуждении и др.).35Рис.
3.1. Спектры флуоресценции (возбуждение 540 нм) БР (3 мкМ) вбуферных растворах (1) и c добавлением САЧ (150 мкМ) (2) при pH 3,5.Рис. 3.2. Спектры флуоресценции (возбуждение 540 нм) БР (3 мкМ) вбуферных растворах (1) и cдобавлением БСА (150 мкМ) (2) при pH 4,0.3612Рис.3.3. Спектры флуоресценции (возбуждение 440 нм) Ф (3мкМ) вбуферных растворах (1) и с добавлением БСА(2) при pH 6,0.12Рис. 3.4. Спектры флуоресценции (возбуждение 520 нм) Э (3 мкМ) вбуферных растворах (1) и с добавлением БСА(2) при pH 7,0.37На рис. 3.5 - 3.8 представлены зависимости стоксового сдвига ∆ν дляисследованных систем. Стоксов сдвиг был рассчитан по методу, описанномув [1]. Из рис.
3.5 – 3.7 видно, что для Э, Ф и Эр в растворах БСА наблюдаетсяуменьшение стоксова сдвига спектров поглощения и флуоресценции. Для БРнаоборот наблюдается увеличение стоксова сдвига спектров поглощения ифлуоресценции (см. рис. 3.8). При этом для Эр и БР зависимость ∆ν от рНимеет аналогичный вид.Рис. 3.5. Зависимости стоксова сдвига спектров эритрозина (1,2) и db (3) отрН в буферном растворе (1) и растворе БСА(2) .38Рис. 3.6.
Зависимости стоксова сдвига спектров эозина (1,2) и db (3) от рН вбуферном растворе (1) и растворе БСА (2) .Рис. 3.7. Зависимости стоксова сдвига спектров флуоресцеина (1,2) и db (3)от рН в буферном растворе (1) и растворе БСА (2) .39Рис. 3.8. Зависимости стоксова сдвига спектров бенгальского розового (1,2) иdb (3) от рН в буферном растворе (1) и растворе БСА(2) .Для Ф (рис. 3.7) и Э (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
