Диссертация (1105109), страница 6

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 6)

3.6) зависимость ∆ν от рН в буферномрастворе имеют немонотонный вид (кривые 1), в то время как в раствореБСА для Ф ∆ν принимает одинаковое значение для всехрН, а для Энаблюдается уменьшение ∆ν с ростом рН.Для описания влияния физических свойств растворителя на спектрыиспускания имеется множество уравнений, например, широко используемоеуравнение Липперта [130]. Однако наиболее корректным является уравнение,предложенное Н.Г. Бахшиевым [131 - 133], которое мы будем использоватьдля анализа полученных экспериментальных результатов.Это уравнение имеет следующий вид [131-133]ℎ = �ɛ−1ɛ+2−2 −1 (22 +1)2�2 +2(2 +2)2,(3.1)40∆bгде =2µ 2 − µ*2 − 2µµ* cos a ) , h − постоянная Планка, с − скорость3(hcaсвета, a − онзагеровский радиус молекулы, ∆ν − стоксов сдвиг (в см-1), n −показатель преломления,ε − диэлектрическая постоянная растворителя,µ* и µ − дипольные моменты флуорофора в возбужденном и основномсостояниях, α − угол между μ и μ*.Параметр∆bхарактеризуетизменениедипольногофлуорофора при его возбуждении.

Сравним зависимости ∆b отмоментарН дляисследованных наномаркеров в растворах белков по сравнению с буфернымирастворами. В связи с тем, что макропараметры (n и ɛ) при данных малыхконцентрациях белков изменяются очень незначительно (практически неизменяются), то вариации стоксова сдвига спектров поглощения ифлуоресценции флуорофоров связано с изменениямиотношения db =∆b . Вычислим∆bбел, где ∆bбел − значение ∆b для растворов с белком,∆bраств∆bраств − для растворов красителей. На рис. 3.5 – 3.8 представленызависимости db от рН для исследованных красителей (кривые 3).

Для Эр, Э иФ db < 1, что указывает на уменьшение угла между µ и µ* , для БР db > 1(этот угол увеличивается). Рассмотрим подробно зависимости db от рН длякаждого из исследованных красителей.Эритрозин (рис. 3.5, кривая 3). В области 3,5 < pH < 6,0 наблюдаетсяуменьшение величины db . Эритрозин может находится либо в нейтральнойформе ( рН < 3,6 ) либо в отрицательно заряженной форме ( 3,6 < рН < 5,0 ).При этом в данной области рН белки в целом положительно заряжены, т.е.изменение дипольного моментов Эр в возбужденном состоянии происходитиз-за электростатического взаимодействия. В области рН > 6,0 белки и Эр вцелом заряжены отрицательно, поэтому электростатическое взаимодействиес ростом рН уменьшается и разность между дипольными моментами в41основномивозбужденномсостоянияхуменьшается(наблюдаетсяувеличение db ).Аналогичная картина изменения db при рН < 5,0 наблюдается и дляэозина, потому что при 3,0 < рН < 8,0 молекулы Э отрицательно заряжены инаходятся в форме дианионов, заряд же белков длярН < pI ( pI -изоэлектрическая точка, равная 4,9 для БСА и 4,7 для САЧ) положителен,поэтому и наблюдается такая зависимость db ( рН ) в этой области рН.

Призначениях рН > pI молекулы белков в целом отрицательно заряжены, ноимеют некоторые участки с положительным зарядом с которым ипроисходит связывание наномаркера. Рост рН приводит к уменьшению числатаких участков и как результат изменениюdb , указывающему науменьшение дипольного момента Э в основном и возбужденном состоянии.Флуоресцеин (рис.

3.7).ПрирН < 4,0 Ф находится в слабоположительноо заряженной форме, поэтому взаимодействия Ф-белокнезначительно. При 4,0 < рН < 6,0 наблюдается эффективное связыванияБСА или САЧ с Ф, т.к. в этом диапазоне рН молекулы альбуминов слабоотрицательно заряжены, а Ф электрически нейтрален. При 7,0 < рН < 8,0исследуемые объекты имеют отрицательный заряд, поэтому изменения врастворах белка между µ и µ* незначительны.Бенгальский розовый. При 3,5 < рН < 4,0 молекулы БР моноанион(заряжен слабо отрицательно). В этой области рН наблюдается увеличениеdb (рис. 3.8, кривая 3). При рН > 4,0 молекулы БР находятся в формедианионов, заряжены сильно отрицательно, что вызывает их экранировкудипольными молекулами воды.

В области4,0 < рН < 6,0 происходитэффективное связывание БР с белками ( db уменьшается). При рН > 4,0(рис. 3.8, кривая 3) БР находится в дианионной форме, что приводит куменьшению энергии связывания белков с зондом.42§3.2.Флуоресцентныефлуоресцеинавхарактеристикирастворахальбуминов.наномаркеровТушениесемействафлуоресценциинаномаркеров.Из рис. 3.1- 3.4. видно, что при растворении молекул наномаркеров врастворах белков наблюдается изменение не только спектральных, но иэнергетическиххарактеристиксвечения(например,интенсивностифлуоресценции). В этом параграфе представлены результаты исследованиявлияниябелковирНсредынафлуоресцентныехарактеристикинаномаркеров семейства флуоресцеина.На рис.

3.9 и3.10 представлены зависимости интенсивности вмаксимуме спектров флуоресценции наномаркеров семейства флуоресцеинаот pH в буферных растворах без и с добавлением БСА и САЧ. Как видно изрис. 3.9 и рис. 3.10 в растворах, содержащих белки, для всех четырехисследованныхмаркеровфлуоресценции в растворахинтенсивностьвмаксимумеспектровальбуминов уменьшается по сравнению сбуферными растворами.Для растворов Ф (рис. 3.9 и рис. 3.10), не содержащих БСА и САЧ, cувеличением pHпроисходит рост интенсивности его флуоресценции,связанное с увеличением отрицательного заряда зонда при повышении pH.Молекулы Ф обладают слабой флуоресценцией при низких значениях pHрастворов (меньше 5,5), так как находятся в слабо положительно заряженнойформе.

При добавлении в буферные растворы Ф белков для всейисследуемой области pH интенсивность свечения красителя уменьшается.Этоуменьшениеинтенсивностифлуоресценцииобусловленовзаимодействием красителя с белком при связывании.Из рис. 3.9 и рис. 3.10 видно, что самое слабое взаимодействиекрасителя с белком происходит при низких pH, когда молекулы альбумина инаномаркера положительно заряжены.

При 7,0 < pH < 8,0 исследуемыеобъекты имеют отрицательный заряд, что вызывает незначительное тушение43Рис. 3.9. Зависимости интенсивности в максимуме спектров флуоресценциинаномаркеров семейства флуоресцеина от pH: Ф (1, 2); Эр (3, 4); Э (5, 6); БР(7,8) в буферном растворе (1, 3, 5, 7) и с добавлением БСА (150 мкМ) (2, 4,6, 8).44Рис.3.10. Зависимости интенсивности в максимуме спектров флуоресценциинаномаркеров семейства флуоресцеина от pH: Ф (1, 2); Эр (3, 4); Э (5, 6); БР(7,8) в буферном растворе (1, 3, 5, 7) и с добавлением САЧ (150 мкМ) (2, 4,6, 8).45флуоресценции. При 5,0 < pH < 6,0 происходит эффективное связываниеБСА или САЧ с Ф (наблюдается наибольшее тушение флуоресценциикрасителя), так как в данном диапазоне pH молекулы альбуминов слабоотрицательно заряжены, а молекулы Ф нейтральны.Для буферных растворов Эр уменьшение значения интенсивностифлуоресценции зонда Эр в растворах без БСА и без САЧ наблюдается толькопри 3,5 < pH < 5,5 (рис.

3.9 и рис. 3.10, кривые 3). Это объясняетсяувеличениемотрицательногозарядаЭриувеличениемдипольнойэкранировки молекулами воды. При pH > 5,5 интенсивность флуоресценцииэтого зонда практически не изменяется. Обусловлено это неизменностьюзаряда данного наномаркера, находящегося в дианионной форме. Придобавлении БСА и САЧ в раствор с Эр видно (рис.

3.9 и рис. 3.10, кривые 4),что интенсивность флуоресценции красителя меньше, чем в растворах несодержащих белки, что объясняется интенсивным связыванием молекулнаномаркера с альбуминами. При этом наиболее эффективное тушениефлуоресценции красителя белками происходит при pH < 5,0. Обусловленоэто тем, что в данном диапазоне pH молекулы белков в целом положительнозаряжены, а Эр находится или в нейтральной (pH < 3,6) или в отрицательнозаряженной форме моноаниона (3,6 < pH < 5,0).В областях pH > 5,0 белки и Эр в целом заряжены отрицательно,поэтому они слабо взаимодействуют друг с другом, вызывая незначительноетушение флуоресценции красителя.maxот pH наблюдается и для Э в буферныхАналогичная зависимость I флmax, достигая прирастворах: с увеличением pH наблюдается уменьшение I флpH > 5,0 постоянного значения (рис.

3.9 и рис. 3.10). Наблюдаемая для Эmaxзависимость I флот pH растворов объясняется изменением заряда молекулкрасителя:при 3,0 < pH < 5,0 молекулы красителя слабо отрицательнозаряжены и находятся в форме моноанионов, экранировка дипольнымимолекулами воды отсутствует, при больших pH молекулы Э становятся46сильно отрицательно заряженными, принимают форму дианионов, чтоmaxвызывает их экранировку дипольными молекулами воды. Зависимость I флот pH для Э изменяется в растворах сывороточных альбуминов, что нагляднодемонстрируется на рис. 3.9 и рис.

3.10 (кривые 6). В этом случае за счетэлектростатического взаимодействия наномаркера с БСА или с САЧ с ростомpHрастворанаблюдаетсяувеличениеинтенсивностифлуоресценцииmaxдля всех рН меньше аналогичной величины длямаркера. При этом I флводных растворов эозина. Во всем рассматриваемом диапазоне pH (от 3,5 до8,0) молекулы красителя заряжены отрицательно и находятся в формедианионов,молекулыжеальбуминовпризначенияхpH<pI(изоэлектрической точка, равная значению 4,9 для БСА и 4,7 для САЧ)заряжены положительно, при значениях pH > pI молекулы белков в целомотрицательно заряжены, но как БСА, так и САЧ имеют некоторые участки сположительным зарядом, с которыми и происходит связывание наномаркера.При увеличении pH количество положительно заряженных участков белкасокращается и эффективность присоединения Э к белкам уменьшается,поэтому и наблюдается уменьшение интенсивности флуоресценции Э (рис.3.9 и рис.

Характеристики

Список файлов диссертации