Автореферат (1091858), страница 2
Текст из файла (страница 2)
coli ER2566/pER-TEVrsTB4, в котором прииндукции образовывался гибридный белок Trx-TEVrs-TB4 (22 кДа), состоящий изтиоредоксина, вспомогательных аффинных последовательностей, сайта расщепления TEV– протеиназой (ENLYFQ) и Тβ4 (Рисунок 1).5Рисунок 1. Структура гибридного белка Trx-TEVrs-TB4.Биомассувыращивалинакачалочныхколбахиразрушалиспомощьюультразвукового дезинтегратора. Гибридный белок очищали с помощью анионообменнойхроматографии и расщепляли TEV – протеиназой по сайту ENLYFQ. После расщеплениягибридного белка полученный дезацетилтимозин β4 очищали с помощью тангенциальнойультрафильтрации. Очищенный дезацетилтимозин бета 4 ацетилировали уксуснымангидридом с выходом 55% от теоретически возможного и очищали с помощью ОФВЭЖХ.
Лабораторный метод позволял получить не более 20 мг целевого пептида с 1 лкультуральной среды. Для получения необходимого для проведения биологическихиспытаний количества рекомбинантного Тβ4 человека необходимо было масштабироватьи оптимизировать процесс получения целевого пептида, то есть разработать технологиюпилотного производства рекомбинантного Тβ4 человека на основе созданной ранеелабораторной методики.1.1 Масштабирование стадии культивирования штамма-продуцента и стадииразрушения клеточной биомассы.В лабораторной методике описан способ культивирования штамма-продуцента накачалочных колбах, в результате которого средний выход влажной биомассы составлял 3г с 1 л культуральной среды.
Замена качалочных колб на полупромышленный ферментёробъёмом 50 л привела к увеличению среднего выхода влажной биомассы до 17 г с 1 лкультуральной среды.1.2Оптимизацияимасштабированиестадиихроматографическойочисткигибридного белка.Гибридный белок в процессе биосинтеза получался в растворимой форме, в связи счем на первом этапе оптимизации нами была исследована возможность обогащенияосветлённого клеточного лизата гибридным белком за счет удаления балластных белков.Для осаждения балластных белков был использован метод термической денатурации,поскольку из научной литературы известно, что тиоредоксин, входящий в составгибридного белка, обладает термостабильными свойствами (рисунок 2).6Рисунок 2. Осаждение балластных белков термической денатурацией: 1 — балластныебелки; 2 — гибридный белок.В диапазоне температур от 45 до 500С агрегировало почти 2/3 всех балластныхбелков.
Потери гибридного белка при этом составили не более 10%. Дальнейшееповышение температуры приводило к экспоненциальному увеличению агрегированиягибридного белка. Обогащение клеточного лизата по гибридному белку позволилоувеличить эффективную нагрузку на сорбент, а также отказаться от градиентного способахроматографии. Гибридный белок элюировали в изократическом режиме буфером,содержащим 0,4 М NaCl (сорбент Q Sepharose XL) (Рисунок 3).АВ67Рисунок 3. А - хроматографический профиль очистки гибридного белка. В электрофоретический анализ фракций гибридного белка после разрушения биомассы,тепловой обработки и анионообменной хроматографии: М — маркеры молекулярноймассы белков; 1 — осветлённый клеточный лизат; 2 — супернатант после тепловойобработки; 3 — осадок после тепловой обработки; 4 — проскок в ходе нанесения; 5 —уравновешивание колонны после нанесения; 6 — элюция; 7 — регенерация колонны.1.3 Оптимизация и масштабирование стадии протеолитического расщеплениягибридного белка.Расщепление гибридного белка проводили сайт специфичной TEV – протеиназой.Для достижения высокого выхода реакции расщепления был осуществлён поиск7оптимального соотношения фермент-субстрат при концентрации восстанавливающегоагента дитиотреитола 3 мМ, температуре 30°С и рН 8.3 (Рисунок 4).
Заданные условияреакции протеолитического расщепления обусловлены активностью самой TEVпротеиназы. При соотношении фермент-субстрат 1/100 степень расщепления гибридногобелка достигла максимального значения, и при увеличении количества TEV-протеиназывыход белка не увеличивался.Рисунок 4. Количество расщеплённого гибридного белка при различном соотношенииTEV-протеиназа/гибридный белок.При заданных условиях выход в реакции расщепления гибридного белка составил90% от исходного количества.1.4Оптимизацияимасштабированиестадиихроматографическойочисткидезацетилтимозина бета 4.Процесс очистки дезацетилтимозина бета 4 от гибридного и остаточного белков припомощи тангенциальной ультрафильтрации, описанный в лабораторной методике,занимал длительное время и, главное, приводил к большим потерям целевого пептида - до25%, поэтому ультрафильтрацию заменили на ионообменную хроматографию.
В качественосителяиспользоваликатионообменнуюсмолуMacroprepHighS(Bio-Rad).Использование ионообменной хроматографии значительно сократило время процессаочистки и увеличило выход целевого пептида до 95%.1.5 Оптимизация и масштабирование стадии ацетилирования дезацетилтимозинабета 4.Исследовали кинетику реакции ацетилирования дезацетилтимозина бета 4(Рисунок 5).8Рисунок 5. Зависимость количества вещества в реакционной смеси от времени реакцииацетилирования дезацетилтимозина бета 4 в лабораторных условиях: 1 —содержаниедезацетилтимозина бета 4; 2 — содержание побочных продуктов; 3 —содержание Tβ4.Условия реакции ацетилирования были отработаны в лабораторной методике,однако, после масштабирования реакции ацетилирования увеличилось время нанесенияреакционной смеси на колонну, что, в свою очередь, приводило к увеличению долипобочных продуктов.
Таким образом, метод ацетилирования, описанный в лабораторнойметодике, подходил только для объёма реакционной смеси до 100 мл. При большемобъёме реакционной смеси значительно возрастали потери целевого пептида.С целью минимизировать потери были подобраны условия, при которых реакцияостанавливалась в момент достижения максимального выхода при доле побочныхпродуктов не больше 4%.
В качестве терминаторов реакции исследовали коммерческидоступные малоновую и лимонную кислоты. Проведённые исследования показали, чтолимонная кислота при концентрации 10 мМ в растворе практически полностьюостанавливала реакцию ацетилирования (Рисунок 6).Рисунок 6. Доля побочных продуктов в реакционной смеси в зависимости отконцентрации кислоты через 1 ч после ее добавления.Мольное соотношение пептид: лимонная кислота составило 1 : 50. Использованиелимонной кислоты в технологическом процессе дало возможность многократноацетилировать непрореагировавший дезацетилтимозин бета 4 с минимальными потерями.9Таким образом, за счёт оптимизации технологии выделения целевого пептидапрактический выход увеличился с 3 до 5 мг с 1 г биомассы (Таблица 1).Таблица 1.
Результаты оптимизации метода. Получение Tβ4 из 20 г биомассылабораторным методом и на основе пилотного производства.Выход,%Разрушение биомассы(гибридный белок)-68085--Анионообменнаяхроматография(гибридный белок)Протеолитическоерасщепление гибридногобелка(дезацетилтимозин β4)Тангенциальнаяультрафильтрация припостоянном объёме(дезацетилтимозин β4)Суммарное ацетилированиес учётом 2 рециклов(Tβ4)ОФ ВЭЖХ(Tβ4)Итог(Tβ4)54480111908475637557905731СтадияРазрушение биомассы(гибридный белок)Температурная обработкаклеточного лизата(гибридный белок)Анионообменнаяхроматография(гибридный белок)Протеолитическоерасщепление гибридногобелка(дезацетилтимозин β4)Катионообменнаяхроматография(дезацетилтимозин β4)Суммарное ацетилированиес учётом 2 рециклов(Tβ4)ОФ ВЭЖХ(Tβ4)Итог(Tβ4)Выход,%Выход,мгСтадияПилотное производствоВыход,мгЛабораторный метод76095684906509513390126951108799909955После масштабирования и оптимизации технологии получения рекомбинантногоТβ4 человека, суммарный выход целевого продукта увеличился с 20 до 80 мг с 1 лкультуральной жидкости.2.
Получение аналогов Тβ4.Из литературных источников известно, что биологической активностью обладает нетолько ацетилированная форма пептида, но и неацетилированная форма рекомбинантногоТβ4 человека, а сама биологическая активность Тβ4 определяется активными сайтами,которые представляют собой короткие пептидные последовательности [Sosne. et al., 2010].Литературные данные и, в первую очередь, тот факт, что ацетильная группа,присоединяемая в результате посттрансляционной модификации к первой аминокислотеTβ4 - серину, никак не связана с биологической активностью пептида и необходима10только для увеличения продолжительности его жизни в токе крови, свидетельствуют отом, что замена этой группы на другие стабилизирующие группы является наиболеелогичным подходом к разработке селективного способа получения аналогов Tβ4 спролонгированным временем жизни.Вкачествереагентовдлямодификациииспользовалибутиральдегидноепроизводное полисиаловой кислоты (ПСК) (14 кДа), ангидрид гексановой кислоты ипропиональдегидное производное полиэтиленгликоля (ПЭГ) (10кДа).2.1 Получение гексаноилтимозина бета 4.Ангидрид гексановой кислоты обладает низкой растворимостью в воде, поэтому вреакционную смесь добавляли менее полярные, чем вода, растворители, такие какацетонитрил и бутанол.
Выход моногексаноилтимозина бета 4 зависел от времениреакции, рН среды, содержания бутанола и ацетонитрила при постоянной температуре25°С. В результате многофакторного эксперимента были определены условия дляпроведения реакции (рН реакционной смеси 3, 15% бутанола, 30% ацетонитрила), прикоторых выход реакции составил 30% от теоретически возможного. Следующей стадиейисследований стало изучение кинетики реакции ацилирования при указанных условиях(Рисунок 7).Рисунок 7. Зависимость содержания продуктов реакции ацилирования от времениинкубации при рН 3, 15% бутанола, 30% ацетонитрила и 25°С: 1 − дезацетилтимозин бета4; 2 − моногексаноилтимозин бета 4; 3 − побочные продукты.Исследование кинетики реакции показало, что выход моногексаноилтимозина бета 4достигает 30% и с течением времени увеличивается незначительно, при этом происходитнакопление побочных продуктов реакции за счёт ацилирования гамма аминогрупплизинов в составе пептида.
Для ацилирования Тβ4 ангидридом гексановой кислотыоптимальным временем инкубирования оказалось 180 мин. На основе полученныхрезультатов была проведена наработка моногексаноилтимозина бета 4 в количествахнеобходимых для биологических исследований. На рисунке 8 изображён профильполупрепаративной хроматографической очистки целевого продукта.11Рисунок 8.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
