Автореферат (1091858), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Профиль полупрепаративной хроматографической очистки продуктов реакцииацилирования дезацетилтимозина бета 4. Колонка Диасорб 130 С16Т, 8мкм, 15Х250мм.Разделение проводили в градиенте 80% ацетонитрила с 0,1% ТФУ 15 - 30%. 1дезацетилтимозин бета 4, 2 – моногексаноилтимозин бета 4, 3-5 – побочные продуктыреакции.Какпоказалоспектрометрическимпептидноекартированиеанализомполученныхвсовокупностифракцийтолькосхромато-масс-втораяфракциясоответствовала N –концевой моноацилированной форме Тβ4.2.2 Получение конъюгата полисиаловой кислоты с рекомбинантным Тβ4 человека.Реакция сиалирования протекает в две стадии.
Результатом первой стадии реакциисиалирования является образование нестабильного основания Шиффа, которое на второйстадии при восстановлении цианборгидридом натрия переходит в стабильный конъюгат.Оптимальные условия реакции определяли путём проведения экспериментов, в которыхвариативными параметрами были соотношение ПСК/белок и содержание ацетонитрилаСодержаниемоносиалированноготимозина бета 4. %(рисунок 9).0% AcCN15% AcCN30% AcCN45% AcCN80706050403020100012345678910Мольное cоотношение ПСК/белокРисунок 9.
Зависимость содержания моносиалированного Тβ4 от условий реакции.На основе этих результатов были выбраны такие условия реакции, при которыхдостигался 58% выход продукта (30% ацетонитрил, ПСК/белок 5/1, рН 4,5-6). Далее былаопределена зависимость выхода моносиалированного Тβ4 от времени (Рисунок 10).12Рисунок 10. Кинетика реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4 при соотношенииПСК/белок 5/1, содержании ацетонитрила 30%, значении рН равном 4,5 и температуре25°С.Через 180 мин реакция практически остановилась, дальнейшее инкубирование былонецелесообразным.
Далее провели масштабирование реакции сиалирования и процессаочистки полученного аналога.В ходе реакции сиалирования Тβ4 получалось несколько разных фракциймодифицированного пептида с разной молекулярной массой (Рисунок 11, В). Связано этобылос неоднородностьюсамойПСК–в исходнойнавеске присутствовалибутиральдегидные производные ПСК с молекулярной массой от 10 до 18 кДа, чтоприводило к распределению продуктов сиалирования дезацетилтимозина бета 4 с разноймолекулярной массой.
Фракции с 3 по 7 (Рисунок 11, А) объединяли и лиофилизовали,полученный лифилизат использовали для биологических исследований.Рисунок 11. A – Профиль полупрепаративной хроматографической очистки продуктовреакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4. Колонка Диасорб 130 С16Т, 8мкм,15Х250мм. Разделение проводили в градиенте 80% ацетонитрила с 5% NH4OAc 8 - 23%.B – Электрофоретический анализ фракций полупрепаративной ОФ ВЭЖХ:М – маркерымолекулярной массы белков, 1-9 – продукты реакции сиалирования дезацетилтимозинабета 4.132.3 ПЭГилирование дезацетилтимозина бета 4.Механизм реакции ПЭГилирования аналогичен механизму реакции сиалирования –реакция идёт с образованием основания Шиффа, с последующим восстановлениемкратнойсвязицианборгидридомнатрия.Вкачествевариативныхпараметровиспользовали рН среды и мольное соотношение ПЭГ/белок (Рисунок 12).
Всеэксперименты проводили при постоянной температуре 25°С в течение 24 ч.Рисунок 12. Зависимость содержания моноПЭГилированного Tβ4 в реакционной смеси отсоотношения ПЭГ/белок при 25°С при различных значениях рН: 1 − рН 4; 2 − рН 5; 3 − рН3.В результате проведённых экспериментов было обнаружено, что при значении рН 4и мольном соотношении белок/ПЭГ 1:4 выход реакции ПЭГилирования достигал 63%.Параллельно с определением оптимального мольного соотношения и рН среды,исследовали кинетическую зависимость реакции ПЭГилирования (Рисунок 13).Рисунок 13.
Кинетическая кривая ПЭГилирования Тβ4 при рН 4, 25°С, ПЭГ/белок 4/1.Проведённые исследования показали, что при значении рН 4, соотношенииПЭГ/белок 4/1 и 18 ч инкубирования достигается максимальный 68% выходПЭГилированного Тβ4. Уменьшение выхода целевого продукта со временем связано собразованием побочных продуктов реакции, а именно ди – и триПЭГилированного Тβ4.Нарисунке14АизображенпрофильполупрепаративнойхроматографиимоноПЭГилированного Тβ4.
Чистоту полученного конъюгата подтверждали методомэлектрофоретического анализа (Рисунок 14, В).14Рисунок14.A–ПрофильполупрепаративнойОФВЭЖХвыделениямоноПЭГилированного Тβ4. 1- дезацетилтимозин бета 4, 2 – моноПЭГилированный Тβ4, 2–побочныепродуктыреакции.B-Электрофоретическийанализфракцийполупрепаративной ОФ ВЭЖХ. М – стандарт универсальных масс, 1 – 3 – фракции послеполупрепаративной ОФ ВЭЖХ.Известно, что молекула ПЭГ обладает высокой гидрофильностью и способнапридавать молекуле белка совершенно новую электрофоретическую подвижность. Каквидно из электрофореграммы, модифицированная молекула Тβ4 располагается в области30 кДа, что не соответствует расчётной массе в 15кДа.
Бутиральдегидное производноеПЭГ располагается в области 25 кДа (Рисунок 14, В, линия Р), что на 5 кДа (массапептида) ниже электрофоретической подвижности ПЭГилированного Тβ4, что являетсядоказательством того, что получен моноПЭГилированный Тβ4.2.4 Подтверждение структуры полученных аналогов Тβ4.Структуру полученных аналогов подтверждали пептидным картированием.
Вкачестве протеолитического фермента использовали Asp-N протеиназу из Pseudomonasfragi. Продукты протеолиза анализировали с помощью ОФ ВЭЖХ. В результатепротеолитического расщепления в совокупности с хромато-масс-сметкрометрическиманализом протеолитической смеси было доказано, что все полученные аналоги Тβ4являются его модификациями по N-концевому серину.2.5 Определение стабильности полученных аналогов Тβ4.Стабильность полученных аналогов Тβ4 и самого Тβ4 определяли на сывороткекрови кролика. Исследование кинетики деградации Тβ4 и его аналогов показало, чтовремя, за которое содержание пептида уменьшилось вдвое для Тβ4 соответствует 2 ч., длямоногексаноилтимозина бета 4 соответствует 8 ч, для моносиалированного Тβ4соответствует 6 ч. и для моноПЭГилированного Тβ4 соответствует 10 ч. Таким образом,все аналоги Тβ4 показали пролонгированное время жизни в сыворотке крови кролика.153.
Разработка интеин-опосредованного метода для производства рекомбинантногоТβ4 из ацетилированного in vivo гибридного белка.Химический способ модификации N-концевого серина Tβ4 ангидридом уксуснойкислоты не является единственным способом селективного ацетилирования пептида.Альтернативным подходом является ферментативный метод ацетилирования, в которомроль ацетилирующих ферментов играют ферменты из класса N–ацетилтрансфераз,использующие в качестве субстрата кофермент – ацетилкоэнзим А.
Ввиду высокойстоимости кофермента промышленное получение Tβ4 ферментативным ацетилированиемin vitro является нерентабельным. Наиболее перспективным с точки зрения производствапредставляется ацетилирование пептида in vivo, при котором мог бы использоватьсяацетилкоэнзим А самой клетки3.1 Создание рекомбинантных плазмид pER–Tb4GyrA–AcSer и pER–Tb4GyrA–AcAla.Для того чтобы создать экспрессионную систему, обеспечивающую синтезгибридногобелкапараллельносN-ацетилтрансферазой,быликлонированыпоследовательности Тβ4 и N-ацетилтрансферазы в полицистронную конструкцию подсильный контроль промотора Т7. В качестве экспрессионной системы использовалсявектор pTWIN I, содержащий последовательности белков Ssp DnaB и Mxe GyrA. Также вданный вектор клонировали олигонуклеотидный дуплекс, содержащий измененную посравнениюсклассическойпоследовательностьШайна–Дальгарно(AGGAGAATAACTAG).
Такая замена двух оснований АТ на ТА в стандартнойпоследовательностиШайна–Дальгарно(AGGAGAАATACTAG)необходимадляослабления связывания РНК с рибосомой на стадии инициации трансляции и, в конечномитоге, для ослабления экспрессии второго гена в полицистронной конструкции (Рисунок15). В качестве ацетилирующих ферментов выбрали аланиновую N -ацетилтрансферазу(RimJ) и сериновую N-ацетилтрансферазу (RimL) Escherichia coli.Рисунок 15. Схема экспрессионных векторов, несущих ген Тβ4, интеина GyrA иаланиновой или сериновой ацетилтрансфераз.
TB4 – ген Тβ4, GyrA – ген интеина, CBD –16ген хитин связывающего домена, RBS 1 – классическая нуклеотидная последовательностьШайна–Дальгарно,RBS 2 – изменённая нуклеотидная последовательность Шайна–Дальгарно (сайт связывания с рибосомой), AcSer – ген сериновой N–ацетилтрансферазы,AcAla – ген аланиновой N–ацетилтрансферазы.3.2 Проверка экспрессии генов штаммов-продуцентов и расщепления гибридногобелка.Сконструированные рекомбинантные плазмиды pER–Tb4GyrA–AcAla и pER–Tb4GyrA–AcSer были использованы для трансформации экспрессионных штаммов E.coliER2566иE.coliС3030.Дляпроверкиэкспрессиигеновштаммы–носителикультивировали при 37°С в колбах с питательной средой, индуцировали при достиженииоптической плотности OD600 равной 1 и культивировали 4 часа. Проведённыйэлектрофоретический анализ показал, что при индукции в штаммах–продуцентахобразовывался гибридный белок Tb4GyrА в растворимой форме, и параллельно сгибридным белком синтезировалась сериновая или аланиновая ацетилтрансферазы.Спонтанное расщепление гибридного белка in vivo отсутствовало.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
