Автореферат (1091858), страница 4
Текст из файла (страница 4)
С помощью программыImageLab была рассчитана продукция гибридного белка, а также сериновой и аланиновойацетилтрансфераз. Во всех четырёх штаммах-продуцентах продукция гибридного белкабыла практически одинакова и составила около 23%, продукция ацетилтрансферазсоставила 8% от общего количества белка клетки. Проверку расщепления гибридногобелка осуществляли на хитиновом сорбенте.
Осветлённый клеточный лизат наносили нахитиновый сорбент и индуцировали расщепление гибридного белка. Анализ фракци послерасщепления показал, что уже через 8 часов расщепление гибридного белка составилоболее 95 %.3.3 Подбор условий ацетилирования рекомбинантного Тβ4 человека in vivo.Для определения штамма – носителя, в котором наиболее эффективно происходилоацетилирование целевого пептида, был проведён ряд исследований. Все четыре штамма–носителя инкубировали, изменяя три параметра: время инкубирования после индукции,питательную среду и температуру инкубирования. Количество ацетилированной формыпептида по отношению к предшественнику было использовано в качестве основной мерыэффективности штамма-продуцента (Таблица 2).17Таблица 2.
Содержание ацетилированной формы тимозина бета 4 Тβ4 (%) при заданныхусловиях инкубированияШтамм и питательнаясредаацетилтрансферазаВремя и37°C 4 ч30°C 8 чтемператураинкубирования17°C 20C3030C3030ER2566ER2566LBSOBLBSOBRimL74±259±150±3RimJ68±355±246±3Rim66±356±245±3RimJ64±253±142±2RimL63±252±340±2Rim63±349±236±3RimL60±347±437±2Rim59±244±130±2Во всех штаммах–носителях в процессе посттрансляционной модификации,независимо от условий культивирования происходило полное удаление формилметионинас N–конца целевого пептида. В результате многофакторного эксперимента были выбраныусловия (E.
Coli C3030 штамм, температура культивирования 37ºC, LB среда, времяинкубации 4 ч.), при которых выход Тβ4 достигал 74% от исходного количествапредшественника. Сравнение двух ацетилтрансфераз показало большую специфичностьсериновой ацетилтрансферазы (RimL). В тех же условиях количество рекомбинантногоТβ4 человека оказалось на 6% больше, чем в случае аланиновой ацетилтрансферазы.Далее провели исследование кинетики ацетилирования пептида в штамме-продуцентеС3030/pER–Tb4GyrA–AcSer в питательной среде LB при температуре 37ºС.
Законтрольные были взяты временные точки 4, 8, 12, 16, 20, 24 и 28 ч. после индукции(Рисунок 16).Рисунок 16. Исследование кинетики ацетилирования штамма-продуцента E. coliС3030/pER–Tb4GyrA–AcSer при 37ºС.Через 20 часов после индукции доля ацетилированного предшественникарекомбинантногоТβ4человекавыросладо93%отисходногоколичествадезацетилтимозина бета 4 и далее практически не увеличивалась. Таким образом,наиболее оптимальное время, за которое ацетилируется практически весь предшественникрекомбинантного Тβ4 человека in vivo, составило 20 часов с момента начала индукции(Рисунок 17).18Рисунок 17.
Хроматографический анализ элюата после аффинной хроматографии.Штамм–продуцент E. Coli С3030/pER–Tb4GyrA–AcSer, температура культивирования37ºС, время индукции 20 ч. Хроматографический анализ проводили на колонке YMC–PackOctyl 5u в градиенте 80% ацетонитрила с 0,1% ТФУ 19–25% со скоростью 0,3 мл/мин.1 – дезацетилтимозин бета 4; 2 – Тβ4; 3,4–низкомолекулярные примеси; 5– конъюгатдитиотреитола с Тβ4.Вещество, содержащееся во фракции под номером 5 является промежуточнымпродуктом реакции тиолзависимого расщепления и представляет собой конъюгатдитиотреитола с Тβ4.
В ходе исследований мы обнаружили, что при доведении рНраствора до 10 гидроксидом натрия происходит щелочной гидролиз данного соединения собразованием дитиотреитола и Тβ4 (Рисунок 18).Рисунок 18. Хроматографический анализ элюата аффинной хроматографии послещелочного гидролиза. Хроматографический анализ проводили на колонке YMC–PackOctyl 5u в градиенте 19–25% ацетонитрила с 0,1% ТФУ со скоростью 0,3 мл/мин.
1 –дезацетилтимозин бета 4, 2 – Тβ4.В итоге выход рекомбинантного Тβ4 человека составил 93% от исходногоколичества неацетилированного пептида. Далее рекомбинантный Тβ4 человека очищали спомощью полупрепаративной ОФ ВЭЖХ и лиофилизовали. Исходя из количестваразрушенной биомассы и полученного лиофилизованного продукта был рассчитан выходцелевого продукта, который составил 20 мг рекомбинантного Тβ4 человека с 1 лкультуры, что сопоставимо с выходом Тβ4, полученному по лабораторной методике.Таким образом, в результате экспериментальных исследований был создан штамм–продуцент E.
coli С3030/pER–Tb4GyrA–AcSer, способный к биосинтезу гибридного белка,состоящего из рекомбинантного Тβ4 человека и мини-интеина Mxe GyrA, и сериновой N –ацетилтрансферазы, способной с высокой эффективностью ацетилировать целевой19пептид. В ходе работы были оптимизированы условия культивирования, при которыхэффективность посттрансляционного ацетилирования белка составила 93%.4 Исследование эффективности рекомбинантного Тβ4 человека в спонтанноймышиной модели хронического дерматита.Работа выполнена на самках мышей линии CBRB с симптомами хроническоговоспалительного поражения кожи спины (изъязвлением и алопецией) двух возрастныхподгрупп: относительно молодых и старых. Мышей опытной группы обрабатывалирекомбинантным Tb4 человека трижды. Мышей контрольной группы обрабатывали потакой же схеме водным раствором глицерина.
Проявление симптомов дерматита у каждоймыши оценивали независимо два экспериментатора двойным слепым методом,одновременно определяли массу мышей. Терапевтический эффект рекомбинантного Tβ4человека оценивали по уменьшению симптоматики заболевания у пролеченныхпрепаратом самок по сравнению с их исходным состоянием и по отношению к контролю.Местная обработка кожи спины мышей рекомбинантным Тβ4 человека не толькоспособствовала достоверному ослаблению симптомов хронического дерматита в обеихвозрастных группах, но и привела к долгосрочному (в течение 2 мес.) сохранениютерапевтического эффекта в оригинальной спонтанной мышиной модели дерматитачеловека.ВЫВОДЫ1.
Проведена оптимизация и масштабирование лабораторной методики получениярекомбинантного человеческого Tβ4, в результате которой увеличен выход Tβ4 с 20 до 80мг с 1 л культуральной жидкости. Разработан лабораторный регламент. На основепилотного производства получена опытная партия Tβ4 в количестве 2,5 г сфармацевтической чистотой для доклинических исследований.2. Получены моноконъюгаты ПЭГ, полисиаловой и гексановой кислот с Tβ4. Былиразработаныэффективныеметодырегиоселективноймодификациипептидапропиональдегидным производным ПЭГ, бутиральдегидным производным полисиаловойкислоты и ангидридом гексановой кислоты. Было показано, что полученные аналогиявляются производными Tβ4, модифицированного по N – концевой альфа аминогруппепептида.
Также разработаны эффективные способы очистки полученных аналогов.Исследование стабильности полученных аналогов показало, что внесённые модификациизначительно увеличили время жизни пептида.3. Разработан эффективный и прямой биотехнологический способ получениярекомбинантного Тβ4 человека на основе интеин-опосредованной экспрессионной20системы,прикоторомобеспечиваетсяполноеудалениеформилметионинаивысокоэффективное (не менее 90%) ацетилирование Тβ4 по N-концевому остатку серина всоставе белка предшественника in vivo.4.Биологическиеисследованияпродемонстрировалиэффективностьрекомбинантного Тβ4 человека в спонтанной мышиной модели хронического дерматита.Обработка кожидостоверномуспины мышейослаблениюрекомбинантным Тβ4симптомовхроническогочеловека способствоваладерматитаипривелакдолгосрочному (в течение 2 мес.) сохранению терапевтического эффекта в оригинальнойспонтанной мышиной модели дерматита человека.СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1.
Макаров Д.А., Муравьева Т.И., Степаненко В.Н., Швец В.И., Есипов Р.С.Оптимизация и масштабирование лабораторного метода получения рекомбинантноготимозина-бета 4 человека до пилотного производства // Биотехнология. – 2014. - № 4. - С.35-442. Моисеева Е.В., Бейрахова К.А., Семушина С.Г., Аронов Д.А., Макаров Д.А.,Есипов Р.С. Эффективность рекомбинантного тимозина β4 в спонтанной мышиноймодели хронического дерматита // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. –2014. – Т. 158. - № 11.
- С. 620-623.3. Макаров Д.А., Есипов Р.С. Разработка способов получения аналогов тимозинабета 4 в виде конъюгатов, устойчивых к деградации в токе крови // Биотехнология. - 2016.- № 2. - С. 57-714. Roman S. Esipov, Dmitry A. Makarov, Vasily N. Stepanenko, Anatoly I. Miroshnikov.Development of the intein-mediated method for production of recombinant thymosin β4 from theacetylated in vivo fusion protein // Journal of Biotechnology. – 2016.
– V. 228. – P. 73–815. Макаров. Д.А., Есипов Р.С. Получение конъюгатов полисиаловой кислоты и ПЭГс рекомбинантным тимозином бета 4. // VI Российский симпозиум «Белки и пептиды»,материалы конференции, Уфа, 2013. Сборник тезисов, С. 215.6. Макаров Д.А., Бейрахова К.А., Есипов Р.С. Оптимизация и масштабированиеметода получения рекомбинантного тимозина бета 4. // ХХV Международная зимняямолодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химическиой биологиии биотехнологии, материалы конференции, Москва, 2013. Сборник тезисов, С. 74.7. Макаров Д.А., Степаненко В.Н., Есипов Р.С.
Разработка подходов полученияацетилированных пептидов in vivo на примере тимозина бета 4. // Международная научнаяконференциипобиоорганическойхимии,21биотехнологииибионанотехнологии,посвященная 55-летию Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук и 80-летию со дня рожденияакадемика Ю.А. Овчинникова, Москва, 2014. Сборник тезисов, С.32.8. Способ получения моноконъюгата полисиаловой кислоты с тимозином бета 4 иковалентный моноконъюгат полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый кдеградации в токе крови: пат. 2605385 Рос. Федерация : МПК A61K38/00, A61K38/17 /Р.С. Есипов, Д.А. Макаров, В.Н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
